3. Полифосфаты и ДНК в клетках грибов

Из встречающихся в больших количествах неорганических соединений в клеточных оболочках грибов, в частности в оболочках конидий Neurospora, найдено много полифосфатов, связывающих около 11% катионов оболочки и образующих в ней солеподобные соединения хитозанфосфаты. У дрожжей фосфаты связаны с глюкопротеидами, и, кроме того, в их оболочках содержится немного нуклеиновых кислот.

Однако роль полифосфатов как высокоспециализированных макроэргов, организующих специфику энергоснабжения и питания грибов, не сводится только к участию в структуре клеточной оболочки и требует специального рассмотрения.

Прежде всего необходимо заметить, что полифосфаты грибов имеют прямое отношение к гранулам так называемого волютина, образующимся в их вакуолях при действии слабых оснований (например, сильно разбавленного аммиака) или основных красителей.

Волютин грибов имеет непостоянный состав в их онтогенезе, способен растворяться не только в кислотах, но и в слабо подщелоченных солях (например, в 0,1 М NH₄NO₃, подщелоченном до рН 8,0 и в 2-2,5 М растворе аммиака) (Беккер, 1956). Его накопление согласуется с нарастанием солерастворимой фракции полифосфатов в процессе активного синтеза нуклеиновых кислот (Кулаев, 1975).

Использование цитохимических методов, таких как сравнительная фотосъемка в световом и ультрафиолетовом микроскопе, обработка сформированных волютиновых гранул рибонуклеазой, окраска их пиронином и толуидиновой синей после извлечения из них нейтрального красного этанолом (рис. 1.3) позволили уточнить их состав. В процессе онтогенеза продуцента пенициллина он менялся от состава чисто полифосфатной природы через промежуточные двуслойные структуры к чисто рибонуклеиновому (Дмитриева, Беккер, 1962). Согласно исследованиям Л. Н. Кац (1964), состав предсуществующего волютина изученного ею актиномицета менялся в диаметрально противоположном направлении - от РНК-волютина к полифосфатному. По всем этим данным можно с достаточными основаниями утверждать, что волютин грибов несхож с истинным предсуществующим волютином прокариотов, а скорее схож с криномом животных.

Рис. 1.3. Волютин, сформировавшийся в виде гранул после витальной окраски мицелия Penicillium chrysogenum, из погруженной культуры в его различных возрастных фазах. Обесцвеченные этанолом гранулы в III и в начале IV возрастных фазах окрашиваются в красноватый цвет толуидинблау и не окрашиваются пиронином, т. е. содержат полифосфаты. Начиная с перехода мицелия в V возрастную фазу они окрашиваются пиронином и в синий цвет толуидинбла, т. е. содержат РНК (Дмитриева, Беккер, 1962)

Что полифосфатный обмен грибов отличается от такового у актиномицетов и бактерий, можно видеть также и по синтезирующим и расщепляющим полифосфаты ферментам (Кулаев, 1975). Как видно из прилагаемой схемы (табл. 1.6), у грибов, бактерий и актиномицетов есть общие энзимы этого обмена, такие как полифосфат-фосфогидролаза (ПФГ), полифосфаткиназа (ПФК) и дифосфоглицерат-полифосфаттрансфераза (ДФГ-ПФТ).

Таблица 1.6. Включение в метаболизм полифосфатов различных ферментов у бактерий, актиномицетов и грибов (Кулаев, 1975) (стрелками показано наличие ферментов в данной группе организмов)

Однако уже такой энзим, как ПФК, переносящий фосфат с АТФ на полифосфат и обратно с полифосфата на АДФ, действует в обоих направлениях только у Eubacteria, а у актиномицетов и грибов только в одном и взаимопротивоположном. У грибов синтез полифосфатов за счет АТФ вообще не возможен.

У форм, причисляемых Н. А. Красильниковым (1970) к актиномицетам, имеются кроме этих еще три энзима: полифосфатглюкокиназа (ПФГК) и полифосфатфруктокиназа (ПФФК), а также полифосфат-АМФ-фосфотрансфераза (ПФ-АМФ-ФТ), отсутствующие у Eubacteria и у грибов. Напротив, грибы обладают, как и в случае многих других их ферментных систем, системой энзимов с действием эндотипа, расщепляющей полифосфаты на разной длины олигомеры в середине их цепи. Эти энзимы действуют в противоположность предшествующим только в кислой зоне рН (оптимальный рН 3,2-3,4) и носят название полифосфатполифосфогидролаз, или полифосфатдеполимераз (ПФД), Они, видимо, имеют адаптивный характер.

Полифосфаты представляют собой чисто неорганические соединения, состоящие из мономеров ортофосфорной кислоты, чаще всего построенные в форме линейных неразветвленных цепей, содержащих от трех, четырех и до 300 мономеров фосфата (Кулаев, 1975):  

Иногда они, видимо, встречаются в форме двухфрагментиого пирофосфата или циклических метафосфатоз (например, три-, тетра- и гексамерных). Возможны также нестойкие сетчатые структуры и более стойкие сочетания фосфорной кислоты с двух- и трехвалентными металлами, образующими сетчатые структуры с фрагментами ортофосфата, как, например, обнаруженные у грибов (Кулаев, 1975), имеющие функции детоксикаторов избытка свободного ортофосфата и запасников фосфора и металлов (рис. 1.4).

Рис. 1.4. Предположительная структура полимерного ортофосфата железа (Кулаев, 1975)

Наиболее распространенная у грибов и энергетически доступная форма высокомолекулярных полифосфатов представляет собой линейные цепи с очень различным числом фрагментов фосфата, существующие в виде непрерывного ряда соединений от пирофосфата (два фрагмента фосфата) до содержащих 300 фрагментов и более высокополимерных форм. Разделение их на фракции с помощью экстракции разными растворителями является довольно условным, однако дает все же возможность связать эти фракции с определенной их локализацией и функциями в клетке. Обычно насчитывают четыре-пять таких фракций (табл. 1.7).

Таблица 1.7. Характеристика степени полимерности разных фракций полифосфатов пивных дрожжей (Кулаев, 1975)

Согласно способу их экстракции эти фракции носят названия кислоторастворимой (ПФ₁, солерастворимой (ПФ₂), щелочерастворимых (ПФ₃ и ПФ₄) и растворимой в хлорной кислоте при нагревании (ПФ₅). Средняя длина цепи и средняя молекулярная масса каждой фракции, как можно видеть из результатов анализа фракций из дрожжей (см. табл. 1.7), последовательно возрастают, достигая длины цепи порядка 260n и молекулярной массы около 30000, При этом четыре из перечисленных фракций были обнаружены у всех подробно изученных в этом отношении грибов (табл. 1.8).

Таблица 1.8. Содержание полифосфатов в клетках Endomyces magnusii. Nearospora crassa и в плодовых телах Gyromitra esculenta в мг фосфора на г сухого мицелия (Кулаев, 1975)

В общем итоге полифосфаты были найдены в мицелии грибов всех обследованных классов, а именно у двух миксомицетов, двух видов мукоровых грибов, восьми сумчатых, двух базидиальных, 13 видов несовершенных и 14 видов дрожжей, т. е. у всех из обследованного 41 вида грибов (Кулаев, 1975). По-видимому, наиболее обильно у грибов представлена фракция ПФ₂, а в наименьшей степени фракции ПФ₃ и ПФ₅, однако их относительное количество сильно зависит от вида гриба, условий его роста и возраста культуры.

Биосинтез конденсированных полифосфатов по всем данным начинается в основном с наиболее высокополимерной фракции, а остальные получаются путем ее деградации. Однако возможны и восходящие синтезы за счет пирофосфата, освобождающегося в метаболических процессах, например при синтезе нуклеиновых кислот. Этим процессом, видимо, объясняется синхронное с синтезом РНК у Neurospora crassa накопление фракции ПФ₂, сочетающееся с уменьшением содержания наиболее лабильной кислоторастворимой фракции ПФ₁ (рис. 1.5).

Рис. 1.5. Изменение содержания в мицелии различных фракций полифосфатов и РНК в процессе роста культуры Neurospora crassa в микромолях РО₄^-3 на 130 мл среды (Кулаев, 1975)

Общие функции конденсированных линейных полифосфатов в клетках грибов весьма схожи с функциями АТФ и состоят в снабжении для метаболических реакций фосфором и энергией, высвобождающейся при разрыве макроэргической связи -О-Р-. Однако у них есть и сильные отличия от АТФ, так как, во-первых, способность их к высокой степени полимеризации дает возможность резервировать большие запасы энергии и фосфора без нарушения гомеостаза клетки (рН, ионной силы, осмотической концентрации и т. д.). Это очень важно для характерных обилием этих соединений низших эукариот (грибов, водорослей и простейших) и прокариот (бактерий, цианей и актиномицетов), так сильно зависимых от, окружающей их среды. Во-вторых, высокомолекулярные полифосфаты обладают определенной специализацией в метаболических процессах. По всей вероятности, наименее специализирована лабильная фракция ПФ₁, участвующая как донор энергии во многих ферментативных процессах и синтезах. Фракция ПФ₂ специфично связана с синтезом нуклеиновых кислот. Более высокомолекулярные фракции участвуют в транспорте через клеточную мембрану Сахаров, переносчика которых они фосфорилируют, а их синтез связан с синтезом полисахаридов клеточных оболочек. Последнее можно видеть по высоким коэффициентам корреляции между накоплением этих полисахаридов и соответствующих им фракций полифосфатов (табл. 1.9).

Таблица 1.9. Коэффициенты корреляции (r) между скоростями накопления различных фракций полифосфатов и полисахаридов у Saccharomyces carlsbergiensis (Кулаев, 1975)

Проведенные Кулаевым, его учениками и рядом других исследователей работы по изучению локализации различных фракций полифосфатов в клетках грибов позволили обнаружить согласованность между процессами, сопровождающими их биосинтез, и местами их накопления в клеточных органеллах. В протопластах Neurospora crassa, освобожденных ферментом улитки от клеточной оболочки, оказались гидролизованными до оставшегося в протопласте ортофосфата обе наиболее высокомолекулярные фракции полифосфатов (ПФ₄ и ПФ₅), что указывало на их локализацию на поверхности клеточной мембраны вблизи от оболочки клетки (табл. 1.10).

Таблица 1.10. Содержание высокомолекулярных полифосфатов в клетках, протопластах, ядрах и митохондриях Neurospora crassa. Данные в мг фосфора/г сухого вещества (Кулаев, 1975)

Дальнейшее фракционирование нативных клеточных органелл с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы и их анализ показали наличие в ядре только одной фракции (ПФ₂), связанной с биосинтезом РНК. Кислоторастворимая фракция (ПФ₁) и большая часть солерастворимой фракции (ПФ₂), скорее всего входящие в состав волютина грибов, остались в протопласте, где, как известно, протекает гриколиз; в месте локализации дыхательной цепи, в митохондриях, полифосфатов не оказалось совсем.

Относительно фосфорных соединений необходимо добавить, что, хотя мы и не имеем сейчас точных критериев для суждения о составе нуклеиновых кислот, можно все же утверждать, что они отличаются у грибов от других организмов по их количественной характеристике. Так, по нашим данным (Беккер, Дмитриева и др., 1972), доля ДНК от общего количества фосфорных соединений в мицелии Aspergillus fumigatus не превышает 7-9%, тогда как. доля РНК достигает 65-70% от их количества. Если сравнить обогащенность клетки ДНК у разных организмов, то выясняется, что по этому критерию, так же как и по числу пар нуклеотидов на клетку, грибы находятся на относительно невысоком уровне сложности организации их генома, приближаясь в этом отношении к низшим беспозвоночным, как моллюски или губки. Они далеко отстают от высших растений, сложность организации генома которых сопоставима с таковой у птиц, рыб и ракообразных (Ленинджер, 1974). Однако при сравнении с бактериями сложность генома грибов оказывается выше на целый порядок (грибы - 0,02-0,17; бактерии - 0,002-0,06 мкг ДНК на клетку).