3. Окислительно-восстановительные ферменты и дыхательные цепи грибов

Реакции, производимые большинством из окислительно-восстановительных ферментов, являются крайне необходимыми для основного обмена грибов, поскольку они участвуют как в получении необходимой для синтетических процессов энергии, так и в подготовке исходных субстратов для этих синтезов, например, в форме восстановления нитратов или сульфатов. Вследствие их интимного участия в построении клеток они чаще бывают эндоэнзимами и имеются у всех грибов.

Окислительные энзимы делятся на: 1) дегидрогеназы, действующие по пути, установленному Виландом с отнятием от субстрата водорода, и 2) оксидазы, действующие, согласно теории Варбурга, через присоединение к субстрату кислорода. Однако это различие нельзя считать принципиальным, поскольку существуют дегидрогеназы, связывающие кислород, а роль большинства оксидаз сводится только к переносу электронов путем изменения валентности входящего в их состав металла. Кроме того, большинство из этих ферментов в восстановленном состоянии действуют как редуктазы (оксидоредуктазы).

Дегидрогеназы в большинстве случаев имеют в качестве коферментов или простетических групп никотинамид или флавины в форме НАД, НАДФ, ФМН или ФАД. В случае НАД-дегидрогеназ вторым кофактором большей частью бывает Zn²⁺, а вторым компонентом органической простетической группы - аденин, как в никотинадениндинуклеотиде. Аденин является также вторым компонентом флавинадениндинуклеотида.

Наилучшим образом изучены дегидрогеназы дрожжей и некоторых плесневых грибов, в особенности Aspergillus niger, Триозофосфатдегидрогеназы дрожжей и А. niger обычно содержат в качестве второго кофактора Zn²⁺, например, представляющая собой однокомпонентный белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, алкоголь - дегидрогеназа, фосфофруктокиназа и ряд других дегидрогеназ, участвующих в гликолитических путях ЭМП и ГМФЭ как альдолаза и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (Bertrand, de Wolf, 1958; Wacker et al., 1958). Необходимость цинка для действия этих энзимов доказывается подавлением активности фермента 1:10 фенантролином. При присоединении двух молекул ингибитора к одному атому Zn²⁺ энзим инактивируется необратимо. В алкогольдегидрогеназе одна молекула ферментного белка комбинируется с четырьмя атомами цинка. Содержащие цинк дегидрогеназы подавляются многими факторами, например, фенантролин связывает цинк, Р-хлормеркурбензоат и Ag²⁺ - активные SH-группы, мочевина - ферментный белок.

Участие в действии таких ферментов в качестве кофакторов НАД и НАДФ было доказано также с помощью гистохимических методов, основанных на образовании формазана из нитросинего тетразолия при инкубации с НАД или НАДФ и с соответствующим субстратом дрожжевых грибов Paracoccidioides brasiliensis и Saccharomyces cerevisiae (Reiss, 1967). В случае Saccharomyces cerevisiae исследовалось этим способом наличие НАДФ-пиридоксинфосфатдегидрогеназы, трансформирующей пиридоксинфосфат в пиридоксальфосфат. При этом помимо установления специфичности этой реакции путем подтверждения эффективности действия всех обнаруженных биохимическими методами ингибиторов (хлормеркурбензоат и антагонист пиридоксина 4-деоксипиридоксин-HCl) было отмечено отсутствие связи этого фермента с митохондриями. С помощью введения акцепторов электронов (дихлорфенолиндофенола или трифенилтетразолиумхлорида, ТТХ) было установлено наличие двух энзимов - НАДН₂- дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы у базидиомицета Oudemansiella mucida, причем дегидрогеназа НАДН₂ оказалась промежуточным переносчиком электронов в дыхательной цепи этого гриба. В случае окисления исходных субстратов с гидрофобными свойствами часто роль промежуточного переносчика переходит к НАДФН₂-дегидрогеназе, для формирования которой необходимо присутствие фосфорилирующего НАД-энзима; НАД-киназы. Именно с формирования этого фермента начинается прорастание конидий Neurospora crassa, и максимум его накопления достигается уже через 30 мин от начала их инкубации в воде (Афанасьева и др., 1982).

В начале интенсивного вегетативного роста гриба, при потреблении углеводов, активность НАД-киназы сильно падает и снова нарастает при спаде интенсивности роста через сутки инкубации. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле было обнаружено, что НАД-киназа у N. crassa присутствует в четырех формах субъединиц с разной молекулярной массой, из которых наиболее высокомолекулярные (I и II) характерны для конидий, а III форма с меньшей в 11,2 раза молекулярной массой преобладает в вегетативном мицелии (Афанасьева и др., 1982).

Дегидрогеназа, содержащая флавины, в частности глюкозооксидаза (β-D-глюкоза: О₂-оксидоредуктаза), содержащая ФАД, была впервые обнаружена Мюллером в отпрессованном соке из Aspergillus niger еще в 1926 г. В дальнейшем она была установлена у А. oryzae, Penicillium notatum, P. chrysogenum, дрожжей и ряда других грибов (Андеркофлер, 19636). Этот фермент, окисляющий глюкозо-6-фосфат в 6-фосфоглюконат, наряду с 6-фосфоглюконатдегидрогеназой был найден также у различных видов Phytophthora (Clare, Zentneyer, 1966). Из других дегидрогеназ в прорастающих спорах Puccinia recondita обнаружена дегидрогеназа яблочной кислоты (Macko, Novacky, 1966), а в спорах грибов-трутовиков Trametes versicolor и Phellinus igniarius - флавин-содержащая ксилозооксидаза. К числу флавиновых дегидрогеназ относится также сукцинатдегидрогеиаза. Участие флавиновой системы в дыхательной цепи было также обнаружено у базидиомицета Oudemansiella mucida, а флавинсодержащие галактозооксидаза и глюкозооксидаза у Polystictus circinatus. Флавиновые энзимы О. mucida типа глюкозо-2-оксидазы оказались способными окислять моносахариды в соответствующие им гексозулозы, например D-арабино-2-гексозулозу (Vole et al., 1978, 1980).

Оксидазы не все способны самоокисляться с присоединением кислорода, как это должно быть исходя из теории Варбурга. Ферменты этого типа скорее можно обобщить, исходя из структуры их простетических групп, которые в подавляющем большинстве случаев представляют собой порфирины со строением тема, составленного из четырех пиррольных фрагментов (рис. 6.13). Азотные компоненты тема способны высвобождать валентности, могущие удерживать в центре этой структуры какой-либо металл. Примером типа такой структуры может служить строение протопорфирина IX (рис. 6.14). Наиболее типичны среди них цитохромы, содержащие железо, осуществляющее реакцию переноса электронов типа

Рис. 6.13. Строение порфиринового ядра; Me - металл

Рис. 6.14. Строение протопорфина IX и тип реакции гемовых ферментов

Биосинтез порфиринов (рис. 6.15) исходит из глицина и сукцинилкоэнзима А, причем при декарбоксилировании и отнятии воды на первом этапе получается 8-аминолевулиновая кислота. При дальнейшей циклизации получается порфобилиноген, из четырех фрагментов которого формируется уропорфирин III. Четвертый этап биосинтеза состоит в потере уропорфирином III четырех молекул СО₂ с трансформацией его в копропорфириноген III, который, теряя еще две молекулы СО₂ и окисляясь, превращается в протопорфириноген IХ. Дальнейшее его окисление с потерей четырех атомов водорода приводит к образованию протопорфирина IХ.

Рис. 6.15. Биосинтез порфирииов (Девис и др., 1966)

У головневых грибов в синтезе цитохромов, видимо, принимает участие цинк, что видно на примере Ustilago sphaerogena, резко повышающего продукцию цитохрома в присутствии повышенных доз цинка. То, что цинк участвует при этом в синтезе белкового компонента энзима, можно видеть из результатов внесения одновременно с цинком специфичного ингибитора и-РНК актиномицина D, который полностью подавляет синтез цитохрома у Ustilago sphaerogena (Brown et al., 1966). Наиболее подробно цитохромы изучались у дрожжей, однако с помощью спектрофотометрии они также были обнаружены у очень большого ряда гифообразующих грибов из всех классов (Lindenmayer, 1965).

В настоящее время у грибов известно восемь видов оксидаз со строением цитохромов, относящихся к трем из четырех известных типов структур этих ферментов. У них встречаются цитохромы а, а₁, а₃, b, b₁, b₂, с и с₁. Не обнаружен у грибов только встречающийся у бактерий цитохром типа d.

Большая часть этих энзимов участвует в переносе электронов в дыхательной цепи, и только два из них (a₁ и b₁) образуются в анаэробных условиях. Цитохром 62 отличается от всех других цитохромов тем, что он постоянно связан с ДНК, состоящей из 30 нуклеотидов, потеря которой, однако же, не влияет на активность фермента. Функции этого цитохрома состоят в специфическом окислении лактата и других оксикислот.

У грибов известен также не вошедший в сводку Линденмейера цитохром Р-450, окисляющий алканы и другие липиды через монооксигеназную микросомальную систему, содержащую кроме цитохрома Р-450 еще НАДФН₂, цитохром Р-450-редуктазу и фосфолипидный компонент (Мауэрсбергер, Матяшова, 1980). Она формируется при росте на n-алканах как единственном источнике углерода и энергии у Candida tropicalis, С. guillermondii, Torulopsis Candida, участвуя в окислении алканов и жирных кислот. При достижении стадии торможения роста дрожжей концентрация цитохрома Р-450 в их клетках значительно снижается. Этот фермент является адаптивным, специфически формирующимся при росте дрожжей на средах с гексадеканом, пальмитиновой кислотой или при использовании эндогенных липидов после исчерпания источника углерода при росте на среде с глюкозой (Ильченко и др., 1980), что было установлено при исследовании культур Candida lipolytica, С. tropicalis, С. utilis, С. guillermondii и Torulopsis Candida Оксигеназиая система, включающая цитохром Р-450 и НАДФН, подавляется оксидом углерода (II), но является цианидрезистентной и нуждается в наличии молекулярного кислорода, предпочтительнее использует алканы со средней длиной цепи, окисляя их сначала в соответствующие алкоголи (и гидроксипроизводные) и альдегиды, а потом в жирные кислоты (Weete, 1980). Пигмент гемопротеин Р-450 был впервые открыт у Saccharomyces cerevisiae в корпускулярной фракции гомогената его клеток.

Путь окисления алканов при посредстве цитохрома Р-450 показан в табл. 6.8. Субстратспецифичные оксигеназы грибов, функционирующие с помощью цитохрома Р-450, изучались в течение последнего десятилетия довольно интенсивно как в целях использования грибов для переработки различного типа углеводородов, так и в целях трансформации стероидов при изготовлении лечебных препаратов типа кортизона. Одним из ранних исследований этой категории было обнаружение у Aspergillus niger железозависимой антранилатгидроксилазы, производящей двойное гидроксилированце антраниловой кислоты, но теряющей эту активность при росте гриба на среде с дефицитом железа или в присутствии о-фенантролнна. Фермент реактивировался в присутствии ферриэтилендиаминтетрауксусной кислоты (Fе²⁺-ЭДТА) илн феррицитрата (Kumar et al., 1973). Позднее у гриба Acremonium sp. была обнаружена НАДФН-зависимая оксигеназа сходного типа, окисляющая этан сначала до этанола, а потом до ацетальдегида и соответствующей кислоты (Davies et al., 1976). Сходство этой оксигеназы с оксигеназой на основе цитохрома Р-450 состояло в том, что в бесклеточном гомогенате она оказалась связанной с фракцией микросом. Однако испытание ее СО-спектра поглощения не дало характерных для цитохрома Р-450 результатов.

Таблица 6.8. Схема окисления n-октана Candida lipolytica при участии цитохрома Р-450 (Weete, 1980)

Способность производить гидроксилирование ароматических углеводородов свойственна мукоровому грибу Cuntnghamella bainieri, причем связанный с этим окислением фермент содержит цитохром Р-450. Фермент НАДФН-зависимый, теряет активность в присутствии типичных для Р-450 ингибиторов (СО, SKF-525A и метирапон), имеет оптимальный рН 7,8 и обладает цианидрезистентностью. Кроме того, он связан с микросомной фракцией и его принадлежность к оксигеназам на основе цитохрома Р-450 подтвердилась его отношением к металлам (например, подавление активности Fe³⁺ и стимуляция ее Fe²⁺/Ferris et al., 1976).

Гидроксилирование с помощью грибов стероидов и другие их трансформации, например, связанные с формированием двойных связей в кольце, также производились, причем преимущественно с применением грибов из числа дейтеромицетов. Способен производить эти трансформации и ряд базидиальных грибов, например, гидроксилирование в положениях 2-β, 7-а, 7-α, 11-α, а также восстановление кетоформ в позициях 20-β в гидроксильную форму. Производить трансформации 3-β-гидрокси-5-андростен-17-она оказался способным базидиальный гриб-дереворазрушитель Pleurotus ostreatus (Thoa et al., 1978). Некоторые виды грибов способны производить и обратные реакции, приводящие к восстановлению окисленных форм гидроксисоединений. Такая реакция, производимая гидроксипируватредуктазой, была обнаружена у Aspergillus niger.

Уже давно было установлено, что цитохромная дыхательная цепь грибов, исключая микросомальные оксигеназы, связанные с цитохромом Р-450, находится в митохондриях. Первоначальные исследования цитохромов грибов проводились спектроскопически на неразрушенном мицелии или на нефракционированном его гомгенате. Из исследованных 45 видов грибов все содержали цитохромы типов а, b и с и цитохромоксидазу (а₃), хотя некоторые из них показывали отличия друг от друга в деталях спектров поглощения.

Позднее исследовалась фракция отмытых при центрифугировании при 10000×g митохондрий базидиомицета Schizophyllum commune, как нативных, так и в присутствии различных ингибиторов (Niederpruem, Hachett, 1961). Дыхание митохондрий ингибировалось соответственно 97, 95 и 85%-м фенилмеркурацетатом, антимицином А, блокирующим дыхательную цепь на уровне перехода между цитохромом b и с и блокирующими цитохром аз цианидом и азидом, а также высокими концентрациями (порядка 10^-3-10^-4) динитрофенола, разобщающего окисление с фосфорилированием. Митохондрии S. commune окисляли НАДН особенно в присутствии цитохрома с, восстанавливающегося при включении в систему цианида. Этими и другими тестами было показано наличие в митохондриях цитохромов b, с и а-а₃, подтверждаемое не только подавлением системы цианидом, но и реакцией подавления дыхания в темноте оксидом углерода (II). В митохондриях S. commune выявлены также сукцинатцитохром с редуктазная, цитохром с, НАДН- и сукцинатоксидазная и цитохром а оксидазная системы. Расчет на основе спектрофотометрических измерений показал четко эквимолярные концентрации в митохондриях а, b и с типов цитохромов.

Исследовался также дифференциальный спектр (при - 196°С) фракции митохондрий Agaricus campestris var. bispora (Gallinet, 1974, 1976), показавший, что в них содержатся цитохромы а-а₃ и, по-видимому, не менее трех цитохромов с пиками поглощения при 552, 557 и 562 нм, а также цитохромы с и c₁. Соотношения цитохромов типов а, b и с были равны 1,0:1,5:2,0 соответственно. Сопоставление этих данных с соответственными расчетами для других видов грибов показывает близкие соотношения цитохромов только у Aspergillus niger, тогда как у дрожжей Saccharomyces carlsbergiensis и Neurospora они увеличиваются для цитохромов b и с более прогрессивно (табл. 6.9).

Таблица 6.9. Подсчет концентраций трех типов цитохромов, определяющих их стехиометрию у разных видов грибов (Gallinet, 1974), нмоль/мг белка

Исследование кинетики восстановления цитохромов Agaricus campestris показало, что у него присутствуют только два цитохрома типа b, которые восстанавливаются в присутствии сукцината, с пиками поглощения при 559 и 562 нм, обнаруживаемые при температуре жидкого азота (-196°С).

Цепь переноса водорода (или электронов), т. е. дыхательная цепь в полном ее виде, включает еще и другие компоненты, а именно ферредоксины и коэнзим Q. Ферредоксины или железо-серопротеины мало изучены в отношении их структуры. Известно, что они включаются в митохондриальный перенос электронов в тесном сочетании с флавиновыми энзимами в процессе их контакта с пиридиновыми дегидрогеназами. В их составе имеется различное количество (от двух до семи атомов) негемового железа и такое же количество лабильных сульфгидрильных групп, освобождающихся в виде H₂S при подкислении. Подробнее изучены ферредоксины - участвующий в фотосинтезе хлоропластов шпината и в усвоении атмосферного азота, выделенный из анаэробного микроба Clostridium pasterianum (Ленинджер, 1974), но считается, что они есть и у грибов (Lyr et al., 1975).

Коэнзим Q относится к числу хинонов, формирующихся в шунте терпенов (рис. 6.16) и совершенно несходных по структуре с цитохромами. К ним относятся обнаруживаемые у грибов убихиноны и убихроменолы.

Рис. 6.16. Строение хинонов, участвующих в транспорте электронов в дыхательной цепи

Убихиноны различного строения обнаружены сейчас у значительного числа грибов, как дрожжевых, так и гифообразующих из классов сумчатых, базидиальных и несовершенных грибов (Lindenmayer, 1965). Образуются они как в анаэробных, так и в аэробных условиях, и установлено их место в дыхательной цепи между флавинами в сочетании с ферредоксинами и цитохромом b (Ленинджер, 1974).

Расположение упоминавшихся выше ферментов в дыхательной цепи и связь ее с метаболитами цикла трикарбоновых кислот приведены на рис. 6.17. Оно слагается из последовательности: НАД → флавопротеид (ФМН) → кофермент Q (убихинон) → цитохром b → цитохром с (или с₁-с) → цитохром а → кислород воздуха. Конечным продуктом реакции является вода.

Рис. 6.17. Схема дыхательной цепи и окислительного фосфоргилирования. Конечные продукты стадий в рамке (Ленинджер, 1974)

Параллельно существует также система, начинающаяся с флавиновой сукцинатдегидрогеназы (кофермент ФАД), субстрат сукцинил-КоА, переносящая электроны прямо на убихинон. Сходный процесс претерпевают продукты распада жиров - глицерофосфат и ацилированные КоА производные жирных кислот (рис. 6.18). Путь переноса электронов через НАД возможен с изоцитрата, малата и пирувата, также с глутамата и различных 3-оксиацилпроизводных КоА. На трех этапах дыхательной цепи может происходить сопряжение окисления с фосфорилированием (образованием АТФ), а именно между ФМН и KoQ, цитохромами b и с, цитохромом а и кислородом воздуха, где это позволяет высокая разность энергетических потенциалов перехода коэнзимов (Е₀').

Рис. 6.18. Места вхождения электронов от различных субстратов в дыхательную цепь и места окислительного фосфорилнрования: ФП - флавопротеины; в скобках уровни E₀', V (Ленннджер, 1974)

Альтернативные дыхательные цепи грибов. Истинное место убихинона (коэнзима Q) в дыхательной цепи грибов вскрылось в связи с исследованиями в области механизма действия различных ингибиторов дыхания (рис. 6.19). Обнаруженные ранее альтернативные пути переноса протонов (двух атомов водорода) - первый через НАД→флавинмононуклеотид (ФМН) и негемовое железо (ферредоксин) (I), второй через сукцинат→флавинадениндинуклеотид (ФАД) и другой железосеропротеин (II) - оказались сходящимися. Место их соединения - это этап цепи переноса, занятый коэнзимом Q, с которого осуществляется передача заряда на цитохром.

Рис. 6.19. Схема главной и альтернативной дыхательной цепи грибов и болокирующих различные этапы ингибиторов. Места действия ингибиторов указаны стрелками с волнистой чертой (Lyr et al., 1975)

Блокирование цианидом, оксидом углерода (II) или азидом этапа цитохрома а + цитохромоксидаза (цитохром а₃) приводит к прерыванию перехода от окисленного состояния к восстановленному и обратно всех компонентов цепочки цитохромов, что на модели клеток животных дает в результате полное прекращение дыхания. Однако у целого ряда нечувствительных к цианиду грибов дыхание при этом не прекращается, причем даже тогда, когда блокируется с помощью ротенона, дексона или амитала начальный этап цепи I через НАД и ФМН. Блокировка антимицином А перехода от цитохрома b к цитохрому c может в этом случае привести даже к стимуляции дыхания. Полное прекращение дыхания достигается только при одновременном с цитохромами блокировании карбоксином, теонилтрифторацетатом (ТТФА) или 8-оксихинолином этапов пути II через сукцинат, ФАД и железосеропротеин. При блоке одних этапов цитохромов дыхание значительно усиливается, не уступая нормальному в контроле (Lyr et al., 1975). Это прямо указывает на наличие альтернативного пути дыхания с усвоением кислорода через иные, чем цитохромы, пока еще не изученные акцепторы. Заблокировать этот путь можно только малонатом или веществами, воздействующими на ферредоксиновый компонент цепи II, как карбоксин, 8-оксихинолин и ТТФА (см рис. 6.19).

На следующем этапе этого альтернативного пути могли бы. возможно, оказаться, например, меланины с их способностью и аутоокислению и восстановлению, хотя до настоящего времени их окисление считается свободным, не связанным с способностью к фосфорилированию. Это в определенной степени поддерживается значительно меньшей потребностью меланинсодержащих форм в кислороде при их дыхании (Жданова, 1976) и цианидрезистентностью при чувствительности к блокаде цепи II окисления темно-окрашенных грибов как Trametes versicolor, Ustilago maydis, виды аскомицетов из порядков Helottales и Sordariales (Lyr et al., 1975). Исключение составляет краснопигментная, но цианидорезистентная Rhodotorula mucilaginosa.

Наличие у грибов альтернативных путей дыхания имеет принципиальное значение для отбора системных веществ, применяемых для борьбы с болезнями растений. Были проведены обширные эксперименты на дрожжевых грибах из родов Torulopsis и Candida, показавшие, что количество альтернативных путей переноса электронов в дыхательной цепи грибов, видимо, достигает значительного числа вариантов. Только у одного Torulopsis Candida, по мнению исследователей, их намечается не меньше четырех (Ильченко, Соколов, 1980). Прежде всего были замечены различия в первых ступенях цепи переноса, заключающиеся в замене блокируемого цианидом обычного пути электронного транспорта цианид-резистентным, формирующимся при росте на нормальных алканах, сопровождаясь продукцией цитохрома Р-450, участвующего в их гидроксилировании до алканолов (рис. 6.20). При росте на глюкозе цитохром Р-450 не появлялся до ее полного исчерпания (Ильченко и др., 1980).

Метаболизм n-алканов (а также, видимо, ряда жирных кислот и липидов), как выяснилось из опытов с ингибиторами, протекает на базе микросомальной фракции цитоплазмы (Ильченко, Соколов, 1980) при участии НАДФ и цитохром-Р-450-редуктазы. Он ингибируется, сходно с подавлением ингибиторами микросомальной оксигеназы, СКФ-525А, метирапоном и бензогидроксамовой кислотой (БГК). Эта система была обнаружена кроме Torylopsis Candida еще у трех видов Candida (С. guillermondii, С. tropicalis и С. lipolytica/Мaуepcбepгep, Матяшова, 1980), которые все были способны утилизировать для роста n-алканы, и отсутствовала у не растущих на этом субстрате видов.

Помимо этой системы, связанной с цианидрезистентным путем, блокируемым БГК (Ильченко, Соколов, 1989), по-видимому, имеется второй устойчивый к цианиду путь переноса электронов, где конечное окисление осуществляется за счет перекиси водорода при участии цитохром-с-пероксидазы. Схематическое изображение описанных путей переноса электронов у Torulopsis Candida приведено на рис. 6.20.

Рис. 6.20. Предположительная схема альтернативных путей переноса электронов у Torulopsis Candida и других дрожжей из рода Candida в зависимости от состава среды и фазы роста: БГК - бензогидроксамовая кислота; АА - аитимиции А (Ильченко, Соколов, 1980)

Среди других альтернативных путей дыхания грибов известно наличие цианидрезистентного митохондриального пути окисления у прообразующих грибов, например у Moniliella tomentosa. У этого гриба такое дыхание возникает под влиянием нормальных пропанола и бутанола, тогда как метанол и этанол не способны его индуцировать. Причина индукции цианидрезистентного дыхания заключается в способности С₃ и С₄ алкоголей интерферировать с окислительным фосфорилированием, что приводит к снижению роста и накоплению этилового спирта (Venderleyden et aL, 1978).

Цианидрезистентность дыхания была также обнаружена у грибов Fusarium sambucinum (Акименко и др., 1981) и Fusidium toccineum (syn. Acremonium fusidioides Gams/Телеснина и др., 1980), изучавшихся в связи с образованием ими антибиотиков энниатина и фузидиевой кислоты. Эксперименты проводились на фоне исследования ингибиторов дыхания. У Fusudium энергообеспечение, способствующее росту биомассы, связано в основном с окислительным фосфорилированием, локализованным в митохондриях, и с дыхательной цепью с включением цитохромов. Введение ингибирующего синтез ферментов этой цепи хлорамфеникола переводило активного продуцента фузидиевой кислоты полностью на цианидрезистентный путь дыхания, и выход антибиотика на единицу биомассы повышался в три раза. Наоборот, при ингибировании цианидрезистентного дыхания салицилгидроксаматом он снижался в 4,5 раза. По этим данным, а также по нарастанию интенсивности цианидрезистентности от неактивных штаммов к обильно продуцирующим антибиотик (в конце ферментации от 15-16% до 90-100% от полной дыхательной активности) можно было вывести заключение, что синтез данного антибиотика тесно связан с ингибируемым гидроксаматами путем свободного окисления, возможно, ароматических веществ, в котором, например, формируются меланины.

В случае биосинтеза антибиотика рода Fusarium, энниатина, сходное исследование привело к несколько иным результатам (Акименко и др., 1981). Интенсивность синтеза энниатина связана потреблением пула АТФ, которое более выражено в период усиленного роста и менее явно в стационарной фазе, в период наиболее активного синтеза антибиотика. Соответственно у активного продуцента переход в конце ферментации на цианидрезистентное дыхание был менее выражен, чем у неактивного. И то и другое говорит о более, чем в случае фузидиевой кислоты, интенсивной связи биосинтеза энниатина с энергетическим обменом и синтезом новых ферментных систем, в частности связанных с затратой энергии гидролиза АТФ.

Авторы указанной работы считают, что цианидрезистентное дыхание, так же как и сверхсинтез метаболитов (например, лимонной кислоты), является вариантом сброса избыточной свободной энергии в случае цианидрезистентного дыхания, протекающего на уровне коэнзима Q в дыхательной цепи. Однако скорее все же можно считать, что синтез лимонной кислоты (или например, этанола) нельзя причислять только к футильным ("бесполезным") циклам, существующим исключительно для сброса лишней энергии, так как эти продукты легко используются в основном обмене. То же касается и близкой по структуре к стеролам и меланинам фузидиевой кислоты. Меланины, как и стеролы, помимо других функций используются в обмене, о чем говорит поддержка ими жизнедеятельности и синтезов, их окисление в процессе дыхания и включение в них не только кислорода, но и меченной изотопам углекислоты. Судя по согласованности эффекта гидроксаматов в отношении синтеза меланинов (Жданова, 1976) и цианидрезистентного дыхания (Телеснина и др., 1980; Акименко и др., 1981), их формирование должно идти именно при участии этого энергодающего процесса на базе полифенолоксидаз. В пользу последней гипотезы в некоторой степени говорят также исследования группы авторов (Трутко и др., 1980) по влиянию на цианидрезистентное дыхание Candida lipolytica дефицита ряда микроэлементов.

Несмотря на сильное угнетающее влияние дефицита железа на синтез всех цитохромов (включая и цитохром с и его пероксидазу), цианидрезистентное дыхание не угнетается, а даже стимулируется при его дефиците у данного организма. Правда, ускорение появления цианидрезистентного пути в дыхательном метаболизме С. lipolytica наблюдается также и при дефиците меди, вследствие чего вопрос о возможной природе цианидрезистентных оксидаз этого организма остается пока в значительной мере открытым.

Полифенолоксидаза. К числу полифенолоксидаз, важных для некоторых путей окисления и формирования меланинов, ранее относили две категории: собственно полифенолоксидазы, или лакказы, окисляющие фенолы, и тирозиназу, окисляющую азотсодержащие соединения с бензольным кольцом, например тирозин или фенилаланин. Сейчас эти ферменты считают за единую группу. Ферменты этого типа, видимо, имеют строение гемов, однако к противоположность цитохромам в их состав входит не железо, а обычно закисная медь. Поэтому грибы, образующие обильно тирозиназу, нуждаются в повышенных дозах меди и могут иногда добывать ее из медьсодержащих фунгици