Иммобилизованные ферменты для получения антибиотиков, диетического питания и кормов

Крупный французский биолог Луи Пастер в одной из своих книг писал: "Последнее слово будет за бактериями". Увы, но эти слова справедливы и до сих пор.

По прошествии нескольких лет успешного применения пенициллина неожиданно он стал терять свою эффективность. В 1972 г. в Мексике вспыхнула эпидемия дизентерии, а в 1975 г. на Филиппинах - эпидемия гонореи. И в том и другом случаях были обнаружены штаммы бактерий, устойчивые к действию пенициллина. "Нечувствительность" бактерий к пенициллину обусловлена синтезом этими бактериями ферментов, инактивирующих пенициллин, пенициллиназ (лактамаз). Пенициллиназы гидролитически расщепляют так называемое β-лактамовое кольцо молекулы пенициллина и превращают его в неактивную пенициллоиновую кислоту.

Заражение бактериальными штаммами, устойчивыми к антибиотикам, против которых, кажется, нет никаких средств, как правило, происходит в больницах. Есть один-единственный выход - изменить молекулы антибиотика, так сказать, по заказу, с тем чтобы защитить его активные группы от "нападения" фермента. Однако едва начинают применять полученные антибиотики, как бактерии путем мутации или переноса генов немедленно синтезируют новые специальные ферменты, которые снова подавляют с таким трудом полученные лекарства. Поэтому для того, чтобы одержать победу в борьбе с бактериями, в борьбе в прямом смысле слова не на жизнь, а на смерть, надо постоянно быть "на голову" впереди, синтезируя новые антибиотики, применение которых еще не "предусмотрено" генетическим аппаратом бактерий.

Устойчивость определенных бактерий к пенициллину пытаются преодолеть путем синтеза производных пенициллина, химически модифицируя боковую цепь этой природной молекулы. Однако для того, чтобы "навесить" новую боковую цепь, надо отщепить данную природой; в результате образуются два продукта: из боковой цепи и из основной части молекулы пенициллина (6-аминопенициллановая кислота).

Отщепление боковой цепи химическим путем протекает в 3 стадии при температуре - 40°С в безводной среде с добавлением органических растворителей. Этим отчасти и обусловлены большие потери антибиотика, поскольку молекула пенициллина может непредусмотренным образом расщепиться и тем самым инактивироваться. Возникающие при гидролизе побочные продукты должны быть отделены, что является трудоемким процессом.

Ферментативный метод расщепления цепи разработан на рубеже 60-х годов. При этом использовали внутриклеточную пенициллинамидазу (которую часто также называют пенициллинацилазой), первоначально в виде растворимого фермента из микроорганизмов. Однако выход продукта по этой методике был очень небольшим и составлял 0,5-1,0 кг на килограмм фермента. В 1960 г. фермент был иммобилизован, и выход продукта резко увеличился. В 1975 г. с помощью 1 кг иммобилизованной пенициллинамидазы получали уже до 50 кг продукта. В настоящее время 1 кг фермента дает 100-250 кг 6-аминопени-циллановой кислоты. Ежегодно в мире получают сейчас около 3000 тонн 6-аминопенициллановой кислоты с помощью примерно 15-30 тонн иммобилизованной пенициллинамидазы.

Причины широкого применения иммобилизованной пенициллинамидазы находятся в прямой связи с высоким выходом продукта при незначительном расходе фермента. Кроме того, для фармацевтической промышленности важное значение имеет отсутствие ферментативных примесей в конечном продукте. Процесс протекает в чистой воде при нормальной температуре без каких-либо побочных продуктов, поэтому расходы на очистку конечного соединения минимальны.

Пример промышленного использования глюкозоизомеразы показал, что с помощью иммобилизованных ферментов можно получать большие количества дешевых продуктов при низких издержках. Пенициллинамидаза открывает еще одну - возможность использования иммобилизованных ферментов, а именно эффективное производство высокоочищенных (и потому дорогих) продуктов в относительно небольших количествах. Глюкозоизомеразу и пенициллинамидазу можно считать "первопроходцами" ферментной технологии; в настоящее время проходят испытания в пилотных установках еще ряд процессов с применением иммобилизованных форм лактазы и аминоацилазы.

У многих людей из-за отсутствия лактазы в тонком кишечнике молочный сахар (лактоза) не расщепляется до глюкозы и галактозы. После потребления молока такие люди страдают расстройствами желудка, вздутием и болями в нижней части живота. До сих пор нет ясности, является ли отсутствие лактазы наследственным. Такое заболевание особенно широко распространено в развивающихся странах, а ведь именно население этих стран особенно нуждается в таком дешевом и одновременно полноценном продукте питания, как молоко. Чтобы у людей с подобными' отклонениями молоко усваивалось, оно было ферментативно обработано с помощью иммобилизованной лактазы. В Италии с 1975 г. работает завод по переработке молока с помощью иммобилизованной лактазы в диетическое безлактозное молоко; ежедневно там выпускается 8000 л этого диетического продукта.

Важные (незаменимые) аминокислоты не синтезируются в организме животных и человека или синтезируются медленно. Они должны поступать в организм с пищей или кормами. Поэтому спрос на незаменимые аминокислоты, используемые в качестве добавок к кормам и в медицинских целях, непрерывно растет. Аминокислоты, синтезированные химическим путем, представляют собой оптически неактивные смеси D- и L-изомеров. Однако физиологически активна только L-форма, и только она используется в медицине и в качестве добавки к кормам. В Японии проф. Сибата и сотр. разработали процесс ферментативного расщепления с помощью аминоацилазы полученных химическим путем ацетил-D, L-аминокислот на L-аминокислоты и негидролизуемые ацетил-D-аминокислоты. Свободную L-аминокислоту легко отделить от ацетилированной D-аминокислоты. С 1969 г. таким путем осуществляется промышленное производство незаменимых аминокислот: L-метионина, L-фенилаланина, L-валина и L-аланина. Интересно сравнить биотехнологию получения аминокислот с использованием растворимой и иммобилизованной аминоацилаз. В случае фермента, иммобилизованного на носителе, издержки производства почти на 40% ниже. Поскольку этот процесс в значительной мере автоматизирован, экономится фонд заработной платы; причем при меньших расходах на катализатор выход продукции выше. Это наглядно показывает преимущества использования иммобилизованной формы фермента.

Недавно к группе иммобилизованных ферментов "присоединилась" и нитрилгидратаза, которая катализирует одностадийное превращение ацетонитрила в акриламид, в то время как традиционными методами это удается сделать лишь в 4* стадии. Технологический процесс разработала японская химическая корпорация "Нитро кемикл индастриз". Опытный завод этой корпорации, использующий иммобилизованный фермент, производит 5 тонн акриламида в год, при этом значительно экономится энергия, поскольку температура реакции снижается от 120°С при обычном производстве до менее 10°С. Кроме того, получаемый акриламид имеет очень высокую степень чистоты, так что его можно использовать для полимеризации без предварительной очистки.