Ферменты помогают ставить диагноз

"В основе болезни лежит неправильное смешение четырех соков тела: крови, слизи, черной и желтой желчи. По составу и внешнему виду соков тела можно, следовательно, сделать вывод о характере и месте заболевания". Это выдержка из "Учения о соках" древнеримского врача Клавдия Галена из Пергама (II в. до н. э.), которое служило руководством для врачей в течение многих столетий. Особенно большое значение придавалось анализу мочи. Цвет, запах и вкус мочи считались надежными показателями болезни. Мочеприемник в форме колбы (matula) стал символом врачей средневековья. Впрочем, очень скоро диагностирование болезни на основе анализа мочи переродилось в шарлатанство. Так, например, считалось, что муть на поверхности мочи указывает на заболевания головы.

Только с помощью современной биохимии анализ "соков тела" был поставлен на научную основу. С открытием ферментов начала осуществляться вековая мечта аналитиков: ферменты позволяют целенаправленно выделять вещества из смеси сотен различных соединений и определять их количество или концентрацию. Высокая субстратная специфичность ферментов, т.е. способность абсолютно точно узнавать свой субстрат, предопределяет их важнейшую роль при анализе смесей веществ.

Каким образом мы узнаем, что произошла какая-то ферментативная реакция? Для этого нужно показать, что в смеси появился новый продукт или что один из субстратов исчез. Например, если фермент превращает бесцветный субстрат в продукт голубого цвета, то сразу же после добавления фермента в присутствии субстрата смесь становится голубой. Чем больше в смеси бесцветного субстрата, тем более интенсивной будет голубая окраска, возникающая под действием фермента. Фактически мы объяснили основной принцип ферментативного катализа. Если же, наоборот, нужно доказать, что определенная смесь содержит, например, вышеописанный фермент, то надо к ней просто добавить бесцветный субстрат и посмотреть, окрасится ли она в голубой цвет.

Две смеси представляют собой интерес для врачей: "особый сок" - кровь и моча. Для диагностики сахарного диабета (diabetes mcllitus) исследуют содержание сахара в крови и моче. Содержание глюкозы в крови больных диабетом может в 10 раз превышать норму в связи с тем, что их организм не способен в достаточной мере использовать глюкозу. Накопившуюся в результате болезни глюкозу организм стремится вывести с мочой. Поскольку "диабетиками" являются 2-3% населения промышленно развитых стран, а 10% населения - потенциальные "диабетики", абсолютно необходима ранняя диагностика заболевания, чтобы предупредить тяжелые осложнения. Для проведения большого числа обследований нужны быстрые, рациональные и точные методы анализа. Определение глюкозы чисто химическим методом может привести к ошибочным результатам, так как используемые при этом реактивы часто вступают в реакцию не только с глюкозой, но и с другими веществами, содержащимися в моче или крови. Поэтому сейчас довольно широко принято определение глюкозы ферментативным методом.

В настоящее время используются в основном три разновидности ферментативного метода анализа: оптический тест, ферментативные тест - полоски и ферментные сенсоры. Говоря упрощенно, при оптическом тесте измеряют поглощение (абсорбцию) света раствором ("проглатывание" света). Проба крови или мочи разлагается в стеклянном сосуде (кювете) уже известной нам глюкозооксидазой. В присутствии глюкозы в пробе сначала наблюдается образование глюконолактона и пероксида водорода H₂O₂ из глюкозы и кислорода (см. в начале). Далее H₂O₂ с помощью добавленного второго фермента (пероксидазы) превращает бесцветный вспомогательный субстрат (глюконолактон) в продукт голубого цвета. Окрашенный раствор поглощает часть света, проходящего через кювету. С помощью фотоэлемента можно измерить уменьшение интенсивности света, которое в конечном счете пропорционально концентрации глюкозы.

В большинстве лабораторий мира для диагностики диабета успешно применяется оптический тест. Он имеет, однако, ряд недостатков. Мутные растворы затрудняют определения и дают неправильные результаты, поэтому пробы должны быть сначала депротеинизированы (из них должен быть удален белок). Собственный цвет мочи также искажает результаты. После каждого измерения проба мочи из кювет выливается, т.е. для каждого определения нужны новые ферменты. Естественно, что использование дорогостоящих ферментов делает и само определение дорогим. Для измерений необходим также фотометр, который вполне может быть установлен в крупной городской клинике, однако подобное обследование в сельских больницах и амбулаториях, а тем более контроль в домашних условиях не всегда могут быть обеспечены.

Рис. 24. Использование ферментов для диагностических целей

Выход из создавшегося положения дает применение ферментативных тест - полосок. Это узкие полоски из материала-носителя (например, бумаги), на которые различными способами в сухом виде наносят те же ферменты для определения глюкозы, как и в оптическом тесте, а также уже упоминавшийся бесцветный вспомогательный субстрат. Полоску покрывают полупроницаемым защитным слоем. При проведении анализа тест - полоски просто погружают в пробы мочи или на них пипеткой наносят пробы крови. После этого начинается реакция. Появляется голубое окрашивание. Сравнивая образовавшуюся окраску со шкалой цветов, определяют содержание глюкозы. Недавно созданные по типу цветной пленки тест - полоски позволяют получать значительно более точные результаты, чем с помощью фотометра. Хотя большим преимуществом тест - полосок является то, что они всегда под рукой, всегда готовы к употреблению и ими легко пользоваться, их, а следовательно, и дорогостоящие ферменты можно использовать только один раз.

В методе ферментных сенсоров, напротив, один и тот же фермент используется для многих сотен измерений. При этом глюкозооксидаза, необходимая для определения глюкозы, заключается в тонкую желатиновую мембрану и таким образом фиксируется (иммобилизуется). Теперь она не может попасть через мембрану в окружающую среду, в то время как маленькие молекулы субстрата (глюкозы и кислорода) легко диффундируют во внутрь. Полученный таким образом ферментный сенсор погружают в исследуемый раствор, содержащий глюкозу. При этом краситель и пероксидаза не требуются, так как один из продуктов реакции, катализируемой глюкозооксидазой, а именно пероксид водорода H₂O₂ - вещество, которое разлагается на сенсорах. Концентрацию H₂O₂ легко можно определить с помощью комбинированного сенсора. Возникает ток, сила которого пропорциональна количеству образующегося H₂O₂, т.е. в конечном итоге расходу глюкозы. Поэтому количество израсходованной глюкозы можно быстро установить по силе тока, регистрируемой амперметром. Примечательно, что ферментные сенсоры можно использовать до тех пор, пока сохраняет активность заключенный в мембрану фермент. С помощью ферментного сенсора, предназначенного для определения содержания глюкозы, можно проанализировать от 60 до 100 проб крови в час. Этот сенсор был разработан д-ром Фридером Шеллером с сотр. (Берлин, Центральный институт молекулярной биологии Академии наук ГДР). Используя один и тот же фермент, можно провести более 5000 определений глюкозы. При этом в случае ферментного сенсора на одно определение в среднем расходуется лишь 1/10000 доля того количества фермента, которое используется в оптическом тесте.

Рис. 25. Принцип действия ферментного сенсора для определения концентрации глюкозы. Благодаря ситовому эффекту мембраны в ферментативный слой из измерительной ячейки попадают только низкомолекулярные вещества. Из них только глюкоза и кислород специфически превращаются молекулами глюкозооксидазы, находящимися в ферментативном слое, в глюконолактон и пероксид водорода H₂O₂. При этом количество образовавшегося H₂O₂, пропорциональное количеству расщепленной глюкозы, может быть измерено с помощью комбинированного электрода. Таким образом, измерив количество H₂O₂, можно определить концентрацию глюкозы в измерительной ячейке

В настоящее время метод ферментных сенсоров получил широкое распространение в мире благодаря своей точности, быстроте и исключительно низкому расходу ферментов. Сейчас ощущается огромная потребность в разработке современных методов анализа для медицины, а также промышленности, сельского хозяйства и охраны окружающей среды. В 1985 г. в промышленности начали применять приборы, основанные на ферментных сенсорах, для определения более 11 соединений, таких, как глюкоза, спирт, лактат, мочевая кислота, аминокислоты, сахароза, лактоза, крахмал и др. В них, как правило, используется один тип окислительных реакций, катализируемых такими ферментами, как глюкозооксидаза, алкогольоксидаза, лактатоксидаза или уриказа, однако возможно и сочетание двух типов ферментов - гидролаз и оксидаз. Например, для того, чтобы измерить содержание крахмала, его надо сначала расщепить амилазами до глюкозы (см. с. ниже), а затем содержание глюкозы можно определить с помощью глюкозооксидазы. Недавно были созданы ферментные иммуносенсоры, а также сенсоры, использующие биокатализ, в форме клеточных органелл, кусочков ткани и целых микроорганизмов.

Наряду с глюкозой, врачам необходимо знать содержание других веществ и ферментов в крови и моче. Например, повышенное содержание мочевой кислоты указывает на заболевание подагрой, для оценки возможности развития сердечно - сосудистых заболеваний надо знать уровень холестерина и триглицеридов, а обнаружение мочевины и креатина в крови помогает диагностировать заболевание почек.

Не только повышенное содержание определенных веществ в крови и моче, но и наличие тех или иных ферментов может указывать на заболевание. Поскольку очень трудно определить концентрацию или абсолютное количество ферментов в крови или моче, измеряют скорость превращения их субстратов, т.е. активность ферментов. Чем выше концентрация фермента, тем быстрее превращается и определенное количество субстрата. В норме содержание ферментов в крови относительно мало. Лишь немногие ферменты (ферменты свертывания крови) принимают непосредственное участие в определенных процессах, происходящих в крови. В клетках организма концентрация ферментов в 1000-100000 раз выше, чем в крови, не говоря уже о моче. Однако в случае заболевания или повреждения какого-то органа или ткани мембраны его клеток становятся проницаемыми и ферменты попадают из клетки в жидкости организма. Поскольку органы выполняют различные функции в обмене веществ, их клетки различаются также по набору ферментов. Поэтому на основании увеличения содержания определенных ферментов в крови и соотношения их активностей можно судить о заболевании того или иного органа. При нарушениях функции поджелудочной железы активность а-амилазы в крови повышается в 30-40 раз по сравнению с нормой. Повреждения костной ткани сопровождаются увеличением активности щелочной фосфатазы, на болезни печени указывает повышенное содержание трансаминаз, о мышечных заболеваниях (например, о повреждении сердечной мышцы при инфаркте миокарда) свидетельствует повышенная активность лактатдегидрогеназы и креатинкиназы в крови. При незначительных повреждениях клеток в кровь попадают только те ферменты, которые находятся в цитоплазме, а при сильных - и мембраносвязанные ферменты. Это позволяет судить о том, насколько сильно поврежден орган.