Как измерить конформацию

Строго говоря, содержание этого раздела можно целиком уложить в одну фразу: в настоящее время существуют экспериментальные возможности для того, чтобы установить пространственное строение данной пептидной молекулы, включая расположение отдельных атомов, с точностью до стомиллионной доли сантиметра. Однако такая лаконичная констатация факта вряд ли придется по вкусу даже читателям, а тем более автору этой книги: дело в том, что так называемая "узкая специализация" автора представляет собой как раз исследование пространственных структур пептидов. Поэтому естественно его желание, подойдя наконец-то к проблемам, действительно хорошо знакомым, уделить им хотя бы несколько страниц.

Итак, методы изучения конформаций пептидов бывают экспериментальные и теоретические; учитывая психологию большинства читателей (особенно читателей-химиков, которые вполне оправданно верят лишь в то, что можно увидеть, пощупать, а еще лучше попробовать на язык, но ни в коем случае не каким-то там теоретическим соображениям), начнем с экспериментальных исследований. Это будет правильным еще и потому, что исторически первыми на пептидную сцену вступили экспериментальные методы: начало их применения к пептидам совпадает с началом 60-х годов, когда все те, кто работал в биохимии и молекулярной биологии, находились под впечатлением выдающихся результатов английских кристаллографов и биофизиков Дж. Кендрью и М. Перутца.

Тщательно изучив картину отражения рентгеновских лучей от кристаллов, образованных молекулами белков, эти ученые смогли восстановить пространственное строение вначале миоглобина, а затем гемоглобина - важнейших белков, обеспечивающих хранение и транспортировку кислорода в крови. При этом исследование не ограничилось только рентгеноструктурным анализом - так стали называть весь процесс целиком: от получения кристаллов белков и их облучения потоком рентгеновских квантов до сложных процедур воссоздания размещения атомов белковой молекулы в пространстве, - а дало еще и четкое представление о том, как именно биологические функции миоглобина и гемоглобина связаны с их теперь уже известной конформацией. Нобелевскую премию за эту работу Дж. Кендрью и М. Перутц получили в 1962 году.

Успехи в установлении пространственных структур белков (а на сегодняшний день рентгеноструктурный анализ проведен уже для сотен различных белковых молекул) не могли, разумеется, не обнадежить желающих получить информацию о трехмерном строении пептидов, тем более что молекулы белков, как известно, в десятки, а то и сотни раз превосходят молекулы пептидов по длине аминокислотных последовательностей. И казалось, методы исследования, хорошо зарекомендовавшие себя при изучении белков, дадут еще лучшие результаты в случае их "младших братьев" пептидов. Однако надежды эти, к сожалению, не оправдались: оказалось, что подчас гораздо легче определить пространственное строение белковой молекулы, состоящей из трехсот остатков, чем пептидной, насчитывающей десять-двенадцать аминокислот.

В этой связи стоит отметить, что причина слабого успеха механического перенесения методов исследования конформаций белков в область пептидных молекул принципиально неустранима: как ни парадоксально, в конечном счете главным фактором здесь становится как раз малость молекулярной массы пептида по сравнению с белком.

Рассматривание под микроскопом

Вот в чем дело: составляющие молекулы пептидов и белков атомы (представляемые нами как шарики на жестких стержнях - валентных связях) способны взаимодействовать друг с другом внутри молекулы - притягиваться и отталкиваться (в первом приближении можно считать, что все пары атомов, которые не образуют начало и конец жесткой валентной связи, соединены слабой пружинкой). Эти взаимодействия, собственно говоря, и заставляют вращаться вокруг одинарных связей отдельные части молекулы в поисках такого положения, когда все межатомные внутримолекулярные пружинки в сумме уравновесят одна другую и конформация молекулы станет устойчивой или, как говорят, равновесной. (Опять же в первом приближении: вообще-то подобные вращения зависят еще и от воздействия соседних молекул - ведь молекула белка или пептида всегда окружена либо молекулами растворителя (например, в организме - молекулами воды), либо, в кристаллическом состоянии, своими двойниками.)

Легко понять, что с возрастанием молекулярной массы растет и число одинарных связей, то есть возможностей внутримолекулярного вращения; иными словами, чем больше молекула, тем большее количество равновесных конформаций она способна в принципе принимать.

Мерой устойчивости этих конформаций или, иначе, величиной, определяющей, какие из теоретически возможных пространственных молекулярных структур действительно имеют шанс реализоваться, служит суммарная внутримолекулярная энергия (скажем, степень натяжения межатомных пружинок): чем ниже ее уровень для молекулы в данной конформаций, тем больше вероятность того, что молекула "попадет" как раз в данную конформацию. Так вот, молекулы очень многих белков, обладая огромным количеством возможных внутримолекулярных вращений, тем не менее устроены так, что какой-то одной из равновесных конформаций соответствует энергия, гораздо более низкая, чем энергии все других потенциально устойчивых пространственных структур той же молекулы.

Это свойство характерно только для биологических полимеров-белков, и благодаря ему молекулы многих белков, в частности, большинство ферментов способны принимать практически единственную уникальную конформацию, за счет чего и обеспечивается высокая специфичность действия фермента в организме. Вспомним, что говорилось о комплексах пептид - рецептор и субстрат - фермент, - в обоих случаях высокая степень подгонки "ключа" к "замку" обусловлена именно пространственным соответствием этих двух компонентов взаимодействия.

Сегодня мы не в состоянии в полной мере ответить на вопрос, почему в молекулах белков энергия одной из конформаций оказывается настолько ниже энергий других пространственных структур, что эти структуры можно смело считать полностью несуществующими (для синтетических полимеров ситуация обратная - имеется много равноправных конформаций с примерно одинаковыми энергиями). Нам ясно лишь, что уникальность пространственной структуры белковой молекулы есть опять-таки следствие биологического фактора - длительного эволюционного отбора, и, рассматривая известные из данных рентгеноструктурного анализа способы укладки длинных белковых цепей в строго детерминированные компактные глобулы (это еще одно название пространственных форм, которые принимают белковые молекулы), мы пока подмечаем только самые очевидные закономерности их строения.

К числу таких закономерностей относится и так называемый принцип плотной упаковки, согласно которому в реальных белковых глобулах как можно больше атомов стремятся расположиться поближе друг к другу, а точнее - на взаимных расстояниях, соответствующих "максимальным степеням сжатия наших гипотетических межатомных пружинок.

Таким образом, каждая пара взаимодействующих атомов вносит свой вклад, пусть и очень небольшой, в понижение общей внутримолекулярной энергии; а поскольку число подобных пар в белке велико, суммарный эффект будет значительным и конформация, удовлетворяющая принципу плотной упаковки, окажется по сравнению с другими в весьма выгодном положении. Если же подобных пар мало - столько, например, сколько их можно насчитать в относительно небольшом пептиде, - то результирующее понижение энергии не сможет выделить "плотноупакованную" конформацию из прочих и, следовательно, молекула пептида будет существовать в виде нескольких практически равноправных конформаций.

Суммируем сказанное: основная "конформационная" разница между пептидом и белком состоит в том, что пептидной молекулы допустимо существование нескольких пространственных структур, а для белковой - только одной (хотя и из этого правила, как и из всякого другого, возможны исключения).

Это обстоятельство сразу же ограничивает, например, возможности рентгеноструктурного анализа пептидов: понятно, что гибкую молекулу пептида гораздо труднее "заморозить" в кристаллическом виде. И, действительно, метод рентгеноструктурного анализа оказался эффективным лишь в отношении немногих (в основном циклических) пептидов, где "разрешенные" конформационные перестройки внутри молекулы не так уж существенны.

Не слишком много удается узнать и с помощью так называемого метода кругового дихроизма уже при исследовании конформаций пептидов не в кристалле, а в более "естественной" для них среде, в растворе. Суть этого метода в том, что поляризованный свет, взаимодействуя с асимметрическими молекулами, изменяет некоторые свои характеристики (в этом и состоит различие оптических свойств "левых" и "правых" аминокислот, о котором упоминалось ранее), причем изменение зависит от взаимного расположения асимметрических атомов в пространстве.

Некоторые конформации пептидных цепей - например, различные типы спиралей, образованных пептидным остовом, - взаимодействуют с поляризованным светом вполне определенным образом, так что их можно сразу "опознать" по изменению параметров светового луча, прошедшего сквозь среду, содержащую молекулы в таких конформациях. Но для того, чтобы такие типы конформации были по-настоящему стабильными, требуются опять-таки согласованные межатомные взаимодействия сравнительно большого числа аминокислотных остатков! А это значит, что спиральные конформации "в чистом виде" встречаются лишь в белках, но не в пептидах: здесь связь между типом конформации и изменением свойств пучка поляризованного света остается, строго говоря, неустановленной (хотя кое-какие попытки исследований в этом направлении проводились и продолжают проводиться).

Поэтому метод кругового дихроизма на сегодняшний день пригоден, в сущности, лишь для проверки, сохранится ли конформация пептида в растворе при изменении каких-то свойств растворителя или, например, вследствии проведенной аминокислотной замены - да и то ответ не всегда будет однозначным. Однако желание отказаться от старых, привычных и хорошо налаженных методах только на том смехотворном основании, что от них мало толку, свойственно научным работникам в той же мере, что и остальным труженикам народного хозяйства; и в результате на страницах научных журналов по-прежнему можно встретить таблицы и графики данных кругового дихроизма пептидных молекул, содержательная ценность которых, увы, весьма невелика.

(Впрочем, в смысле чисто профессиональной инертности научные работники все же отличаются - или, по крайней мере, теоретически должны отличаться - от других представителей умственного труда, поскольку не прекращающееся ни на миг развитие науки ставит их в особое нравственное положение. Еще несколько лет тому назад автор не отдавал себе в этом отчета; но как-то ему довелось рассказывать о занимающих его научных проблемах хорошему знакомому-гуманитарию. И в тот момент, когда ничего не подозревающий автор безмятежно повествовал, как ему с коллегами приходится выдвигать все новые теоретические гипотезы и отбрасывать их с появлением новых, противоречащих гипотезам экспериментальных данных, знакомый не выдержал и выразил свое возмущение крайней беспринципностью автора.

В самом деле, научный работник, пусть даже и не "изображаемый в последнее время художественной литературой и искусством как образец для подражания, все же должен иметь достаточно твердые убеждения, особенно в том, что касается его основной деятельности. Но вдруг оказывается, что какого-то одного или двух экспериментальных фактов хватает, чтобы убеждения научного работника не просто поколебались, а порой изменились кардинальным образом и от одной гипотезы он переметнулся к совершенно иной! А где же принципиальность? Где моральная несгибаемость занимаемой позиции? Где стремление не щадя живота своего отстаивать точку зрения, выстраданную, быть может, всем прошлым опытом? Надо сказать, что поначалу автор оторопел было, ибо взгляд на логику познания как на непрерывную цепь беспринципных компромиссов и предательств по отношению к покидаемым без сожаления вариантам теорий и гипотез ему удалось усвоить не сразу. Зато теперь, по зрелом размышлении, он понимает, что необходимая для подлинного развития науки гибкость мышления тех, кто в ней работает, действительно может показаться чем-то вроде приспособленчества не только уставшим от непомерных интеллектуальных усилий индивидуумам с учеными степенями, но и вполне симпатичным сверхпринципиальным Дон-Кихотам. Что ж, остается лишь смириться с тем, что лирикам так и не суждено, по-видимому, понять физиков до конца. А жаль.

После такого полуфилософского отступления как-то не хочется возвращаться вновь к суховатому описанию методов исследования пространственных структур пептидов. Но, поскольку впредь речь пойдет об успехах, а не о неудачах таких методов, будем надеяться, что последующее изложение будет более живым. Итак, отметим прежде всего, что к настоящему времени эксперимент способен установить целый спектр конформационных характеристик пептидной молекулы, начиная от общего представления о ее пространственной форме до расстояний между отдельными атомами. Соответственно, существует и целый спектр методов, предназначенных для этого, но самым информативным и наиболее универсальным из них повсеместно признан сейчас метод ядерного магнитного резонанса (сокращенно ЯМР).

Не вдаваясь в очень сложное переплетение законов атомной и ядерной физики, обусловливающее само явление ядерного магнитного резонанса, ограничимся внешней стороной дела: если поместить молекулу в очень сильное магнитное поле с постепенно "меняющейся" частотой излучения, то атомы молекулы будут "откликаться" на воздействие этого поля, причем каждый - на своей частоте. Примерно так же натянутая струна музыкального инструмента резонирует и "откликается" на звук камертона; если менять частоту колебаний камертона, то можно заставить звучать поочередно все струны. "Отклики" атомов молекулы на магнитное поле специальным образом записываются, и их взаимное сопоставление позволяет получить самые разнообразные сведения о конформации молекулы.

Можно узнать, например, какие атомы расположен вблизи друг от друга; какие атомы взаимодействуют с растворителем и, значит, находятся "снаружи" молекулы, а какие, напротив, прикрыты от растворителя другими частями молекулы; можно определить даже углы поворотов отдельных фрагментов молекулы вокруг некоторых одинарных валентных связей. К сожалению, такого рода данные удается установить не для всех атомов; однако, если вводить в молекулу особые сорта атомов и функциональных групп (например, изотопы углерода или азота), диапазон применения методов ЯМР существенно расширяется.

Кроме того, не следует забывать, что в нашем распоряжении есть методы, иные, чем ЯМР, о которых было упомянуто лишь вскользь; а между тем они включают в себя, например, так называемый флюоресцентный анализ, благодаря которому очень точно определяется расстояние между некоторыми типами боковых цепей аминокислотных остатков, входящих в состав пептидов. Так что в целом картина обнадеживает: представление о пространственной структуре пептидной молекулы в растворе наверняка может быть получено с помощью экспериментальных методов исследования, причем представление довольно подробное. Учитывая, что объект исследования - молекула, то есть совокупность атомов общим размером всего в несколько стомиллионных долей сантиметра, которую не разглядишь ни в какой микроскоп (даже электронный), современная наука имеет все основания гордиться этим достижением. Приятно к тому же отметить, что советские ученые и в этой области занимают достойное положение: одним из признанных авторитетов в исследованиях пептидов методами ЯМР является, например, член-корреспондент АН СССР В. Быстров.

Итак, конформацию пептидной молекулы можно измерить экспериментально. Однако испокон веку для гарантии полноты изучения объекта принято использовать также и теоретические методы. Вспомним, например, древнюю легенду о таинственных знаках на стенах дворища вавилонского царя Валтасара, знаменовавших окончательный приговор его нечестию. "Мане, текел, фарес", - гласила надпись, начертанная огнем во время роскошного пира, что значило: "Измерено, сосчитано, определено", то есть для определения печальной участи Валтасара провидение пользовалось, очевидно, не только экспериментальными измерениями, но и теоретическими расчетами. За давностью лет трудно определить, настолько ли уж нужны были расчеты виновности вавилонского владыки, но в необходимости теоретических подходов к проблеме конформационно-функциональных отношений пептидов сомневаться не приходится, и последующий раздел придан пояснить эту необходимость.