Слепые перед слоном

Словосочетание "черный ящик" появилось в нашем обиходном языке после окончательного признания кибернетики. Это понятие означает некий участок, исправно работающий в системе управления, но внутри устроенный неизвестно как: известно лишь, что при поступлении к нему на вход сигнала данного типа на выходе появляется другой сигнал, должным образом переработанный.

Легко видеть, что, как можно понять из предыдущего изложения, молекулярные механизмы, реализующие биологическую реакцию организма на данный тип пептидного биорегулятора, во многом схожи с "черным ящиком" - по крайней мере, для теперешнего состояния соответствующей науки. И хоть не хочется, выйдя на молекулярный уровень, возвращаться к поговорке, связывающей лошадь и ее хвост, приходится признать, что иным способом внутреннюю структуру биологического "черного ящика" исследовать невозможно.

Впрочем, таков вообще один из основных приемов научного исследования. Когда-то в древности восточные мудрецы придумали притчу о трех слепцах, ощупывающих слона: на вопрос о том, каков из себя слон, первый, трогавший хобот, сказал, что слон мягкий и гибкий; второй, которому попались бивни, утверждал, что слон гладкий и твердый; а третий, стоявший вплотную к туловищу, говорил, что слон огромный и шероховатый.

Эта история, наполненная глубоким философским смыслом, в последнее время почему-то стала предлагаться в качестве забавного анекдота: предполагается, очевидно, что слушатель должен испытывать чувство превосходства над незадачливыми слепыми, неспособными получить объективное впечатление о слоне в целом. Но ничего достойного самодовольного веселья в этой изящной миниатюре нет: более того, она поистине поучительна, ибо очень верно отражает картину неизбежного несовершенства способов, которыми человек изучает все, лежащее за пределами его собственного "я". А несовершенство способов ведет к несовершенству выводов: каждый из слепцов был прав лишь частично; но ведь то же самое можно сказать и по-другому - хоть частично, но каждый из слепцов был прав.

Что ж, уподобимся слепым перед слоном и начнем по-всякому испытывать биологический "черный ящик": будем подавать ему на вход различные пептидные биорегуляторы и наблюдать за эффектом на выходе. Учитывая при этом, что входом в нашем случае является специфический рецептор, способный к комплексообразованию лишь с данной пептидной молекулой, будем использовать в качестве пробных сигналов аналоги этой молекулы: тогда одновременно с проблемой исследования устройства "черного ящика", может быть, удастся и отобрать аналоги, наиболее перспективные с точки зрения драг-дизайна (что, между прочим, и является нашей основной, хоть и несколько подзабытой уже задачей).

Биологическим тестированием

Описанная процедура существует отнюдь не только в нашем воображении, напротив, она действительно представляет собой одну из основ драг-дизайна, называемую биологическим тестированием, и поэтому есть смысл остановиться более подробно на описании ее принципов, методов и результатов.

Наиболее распространенный из способов биологического тестирования изобретен, вполне возможно, теми подозрительными владыками, которые ввели должность придворного отведывателя - человека, в обязанность которого входило пробовать каждое блюдо, подаваемое к столу властелина: если отведыватель оставался в живых, стало быть, в данное яство яд положен не был и его можно было без боязни употреблять по назначению. Таким образом, биологический эксперимент производился над организмом в целом (биологи и медики сказали бы: эксперимент in vivo - "в живом" по-латыни) и, в принципе, мог дать ответ лишь типа "да" или "нет". С тех пор эксперимент in vivo существенно усовершенствовался и выглядит совсем по-иному.

Прежде всего люди в качестве объектов воздействия различных ядов, лекарств и прочих еще неизвестных веществ были заменены лабораторными животными: крысами, мышами, морскими свинками, кроликами, собаками, кошками, а иногда - настоящими свиньями или даже обезьянами. Конечно, в известной мере это был шаг назад - ведь организмы всех этих животных все же отличаются от человеческого, но, думается, вряд ли кто-нибудь сожалеет о таком отступлении.

(Кстати, однажды автор все-таки видел в одном из американских научных журналов поразившее его сообщение о тестировании на добровольцах - людях нового аналога ангиотензина, действие которого не проверялось предварительно на животных.)

Далее, понадобилось перейти от оценки биологического эффекта в терминах "да - нет" к его более точному измерению. Для этой цели прежде всего выбирается измеряемая биологическая реакция организма, например, увеличение уровня давления крови на двадцать (или тридцать, или сорок) миллиметров ртутного столба: биологи и медики в особенности не любят этих новомодных гектопаскалей. Затем определяется так называемая пороговая доза стандартного соединения: допустим, желаемое изменение давления происходит при введении крысе ангиотензина в объеме столько-то микрограммов на килограмм ее веса; величина этой дозы принимается за единицу или за сто процентов. А уже после этого величина может быть выражена по отношению к стандарту.

Положим, например, что какой-то аналог ангиотензина вызывает условленную биологическую реакцию - повышение давления на двадцать миллиметров ртутного столба, но для достижения такого эффекта крысе необходимо ввести в пять раз больше микрограммов на килограмм, чем при введении самого ангиотензина. В этом случае величина активности аналога будет определена как двадцать процентов или ноль целых две десятых активности ангиотензина.

Иногда размер пороговой дозы вводимого соединения определяется по-другому: как предел, при котором наступает насыщение биологического эффекта. То есть, скажем, начиная с некоей величины увеличение дозы аналога уже не приводит к повышению давления; впрочем, такой пример не слишком правдоподобен, потому что для ангиотензина и его аналогов предел повышения давления крови может быть и не достигнут: крыса погибнет еще до этого.

В связи с упомянутым печальным событием стоит сказать несколько слов о судьбах лабораторных животных вообще. При любом научно-исследовательском заведении, всерьез занимающемся драг-дизайном, как правило, существует виварий - место, где выращивают и готовят к предстоящим экспериментам мышей, крыс, кроликов и прочую живность. Все эти звери живут намного комфортабельнее своих сородичей в подвалах, на чердаках или даже на кроличьих фермах; достаточно просмотреть, скажем, "Правила содержания лабораторных животных", принятые в Японии, чтобы убедиться в этом: японцы регламентируют не только форму клеток или калорийность рациона, но и, например, способ уничтожения экскрементов.

Многие лабораторные животные имеют прямо-таки дворянское происхождение: чтобы исход биологического эксперимента не зависел от случайных неконтролируемых генетических факторов, для него стараются использовать так называемых линейных животных, членов одного и того же семейства, постоянно скрещивающихся между собой. Иногда удается даже специально вывести линию с теми или иными генетическими особенностями: так, тестирование антигипертензивных препаратов теперь можно проводить на особой породе крыс с наследственной ренальной гипертензией.

Одним словом, хорошо содержащийся виварий всегда представляет собой законную гордость его владельцев и предмет непременных посещений уважаемых гостей: их проводят по сверкающим чистотой помещениям, заботливо осведомляясь, не пахнет ли чем-нибудь, и, действительно, пахнет не чем-нибудь, а скорее шампунем.

Средней мощности виварий производит обычно несколько десятков тысяч животных в год (в основном мыши и крысы), жизнь и смерть которых полностью подчинена нуждам биологических исследований. Да, и смерть: методы умерщвления использованных животных также регламентированы вплоть до последующего обязательного кремирования.

Тем не менее, несмотря на чуть ли не законодательные гарантии, обеспечивающие сытое и обеспеченное существование лабораторных животных, работающие с ними экспериментаторы периодически подвергаются яростным нападкам возмущенной общественности. Хлесткое слово "вивисекторы" в смысле "уродующие живое" существует вот уже более века, и даже выдающийся писатель Г. Уэллс, сам получивший очень неплохое естественное образование, не удержался от изображения - пускай и в виде утопии - отталкивающей фигуры врача-вивисектора в своем "Острове доктора Моро". А уж в наступившие дни всеобщего гуманизма страдания мучеников науки - лабораторных мышей и крыс - становятся объектом пламенных выступлений периодической печати, призывающих покончить с варварским обычаем экспериментирования на животных, повсеместно признанных ныне нашими меньшими братьями. В общем, как писал замечательный советский поэт Н. Олейников:

 ...Ты, подлец, носящий брюки, 
 Знай, что мертвый таракан - 
 Это мученик науки, 
 А не просто таракан.

Поэт шутил, но многие авторы неоднократно всерьез предлагали (разумеется, в массовых изданиях) перейти от крыс, скажем, к микроорганизмам, у которых отсутствует нервная система и страдания которым тем самым недоступны.

Увы, эти предложения никак нельзя признать конструктивными, даже если вследствие сугубо гуманитарного мироощущения считать, что человек отличается от бактерии лишь размерами, но не внутренним устройством. Достаточно задать вопрос: а как тестировать вещества, действующие непосредственно на нервную систему? И сразу станет ясно: без использования лабораторных животных при поиске новых лекарств обойтись невозможно. Другое дело, что нельзя допускать излишне жестокие эксперименты, причиняющие мучения, которые совершенно необязательны (а такое, к сожалению, еще бывает), но полностью исключить неудобства и тем более неизбежную гибель лабораторных животных во славу науки все равно не удастся. Остается лишь создавать им описанные выше роскошные условия проживания да изредка воздвигать в их честь памятники, как поступил И. Павлов в своих Колтушах, увековечив Собаку - терпеливую помощницу в его экспериментах.

Впрочем, эксперименты in vivo зачастую не удовлетворяют не только противников вивисекции, но и самих исследователей, особенно занимающихся проблемами пептидного драг-дизайна. Их претензии связаны прежде всего с тем, что организм, как мы не устаем повторять, весьма и весьма сложен, и гарантировать, что в каждом данном случае возникающий биологический эффект обусловлен только введением исследуемого пептидного аналога, было бы слишком рискованно. К тому же остается неясным место действия аналога: между тем в этом отношении пептиды особенно избирательны. И, наконец, тот факт, что для аналога, лишенного, к примеру, ароматического фенольного кольца, пороговая доза в сто двадцать раз больше, чем для природного пептида (то есть он обладает активностью, меньшей в сто двадцать раз), еще ничего не говорит о самом интересном: об особенностях его взаимодействия с рецептором. В самом деле, остается неясным, то ли из-за потери упомянутой функциональной группы аналог утратил способность комплексообразования с рецептором (ключ перестал породить к прорези замка), то ли такой "изуродованный" налог не может более активировать рецептор (ключ ходит в замок, но не поворачивается).

Иными словами, биологическое тестирование in vivo обычно дает, как принято говорить, недифференцированную оценку активности аналогов пептидных биорегуляторов без разделения величин, характеризующих степень связывания аналога с рецепторами и уровень их активации. А именно эти характеристики, как легко понять, очень важно знать для того, чтобы поиск новых биологически активных пептидных препаратов стал действительно направленным. Подобные соображения и привели к тому, что методы тестирования in vivo, обладавшие ранее своего рода монополией, начали лет двадцать назад сменяться другими экспериментальными процедурами (в первую очередь тестированием аналогов на изолированных органах), сохранив, однако, в некоторых аспектах свои позиции непоколебимыми.

Эксперименты на изолированных органах начинаются, строго говоря, с выбора подходящего органа: он должен быть сравнительно легкодоступен, содержать рецепторы, специфические для данного пептида, и обладать четко выраженной биологической реакцией на этот пептид. При этом реакция выбранного изолированного органа может иметь весьма слабое отношение к основной реакции организма в целом на рассматриваемый пептидный биорегулятор.

Так, например, классическим объектом для биологического тестирования аналогов уже хорошо знакомого ангиотензина является полоска стенки желудка кролика, которая, если ее поместить в специальный раствор, исправно сокращается при введении в раствор ангиотензина, хотя для главного действия ангиотензина в организме, регуляции давления крови, подобное сокращение вроде бы и ни к чему. Тем не менее в данном случае характерным для ангиотензина биологическим эффектом считается именно сокращение (то есть уменьшение относительной длины) полоски желудка, причем, что важно, не только величина сокращения, но и динамика изменения этой величины; как мы уже знаем, с увеличением дозы пептида любая биологическая реакция возрастает вплоть до уровня насыщения.

Так вот, тестирование на изолированном органе - полоске желудка кролика - в том и состоит, что для различных постепенно увеличивающихся доз пептидного биорегулятора измеряются и фиксируются соответствующие величины сокращений.. В конце концов, когда дальнейшее сокращение органа уже невозможно, в руках исследователей остается как бы "протокол" эксперимента - кривая роста величины сокращения, которую обычно удается представить функцией двух параметров: уровня насыщения ("потолка") кривой и скорости ее роста. Первый из этих параметров связывают с эффективностью активации рецепторов, второй - со способностью пептида образовать, с рецептором комплекс. Тем самым, и получаются требуемые дифференцированные оценки активности пептида.

Описанные кривые зависимости величины биологической реакции от дозы испытуемого вещества можно, конечно, попытаться получить и в экспериментах in vivo на животных в целом (кстати, тестирование на изолированных органах часто называют опытами in vitro - дословно "в стекле", имея в виду в пробирке, в колбе). Но это редко удается сделать, хотя бы из-за упоминавшейся гибели крыс, так и не испытавших максимально возможного предела повышения давления крови. А изолированный орган в этом смысле намного удобнее: уровень насыщения реакции достигается практически всегда, после чего достаточно как следует промыть ту же полоску желудка в физиологическом растворе, и, освобожденная от действия вещества, вызывающего сокращение, она вновь расслабится и будет готова к новому эксперименту.

Стандартная процедура тестирования аналогов это и предусматривает: вначале строится "калибровочная" кривая для природного биорегулятора, а затем орган отмывается, и получают кривую такого же типа, но уже для аналога, и, сопоставляя уровни насыщения и скорости роста обеих кривых, делают выводы относительно способности аналога к комплексообразованию и активации специфических рецепторов.

Эксперименты in vitro хороши еще и тем, что уровень активности ферментов в изолированных органах существенно ниже, чем в организме, и значит, можно практически не учитывать в построении моделей биологического действия пептидов то обстоятельство, что в ситуации in vivo до рецепторов добирается лишь часть молекул биорегулятора, не съеденная ферментами, причем какая это часть - заранее неизвестно. Кроме того, тестирование на изолированных органах позволяет довольно детально изучить различные стороны очень важного явления в молекулярном мире пептидных биорегуляторов (и не только пептидных), называемого антагонизмом.

В наши дни уже трудно найти человека, достигшего совершеннолетия, ни разу не услыхав об антагонистических и неантагонистических противоречиях, которые и есть, как учит философия, двигатель всякого прогресса. Поэтому остается лишь напомнить, что это слово происходит от греческого "антагонистес", означающего "противник, соперник", и для наших целей можно считать, что агонист - это что-то (или кто-то), действующее (действующий) в направлении достижения какой-то цели, а антагонист, наоборот, что-то противодействующее агонисту. Например, бог является агонистом добра, а дьявол, наоборот, его антагонистом; то же самое, впрочем, можно сказать и по-другому: дьявол - агонист зла, а бог - его антагонист.

Любой из нас наверняка не раз встречался на своем жизненном пути с антагонистами различного рода: от одноклассника, вежливо предлагающего выйти и честно и содержательно обсудить некоторые разногласия, возникшие между вами в ходе вечера на дискотеке, до сослуживца, который, как оказалось, несколько лет исподтишка задерживал ваше продвижение по службе, запугивая профсоюзную организацию рассказами о вашей мнимой моральной неустойчивости. Классификацию таких антагонистов желающие могут провести сами на примерах, заимствованных из художественной литературы, причем примеров наверняка будет более чем достаточно, а классификация получится неоднозначной. В то же время интересующие нас в данный момент типы антагонистов пептидных биорегуляторов поддаются сравнительно строгой классификации, что стало возможно как раз благодаря развитию методов биологического тестирования.

Дело в том, что после добавления некоторого количества вещества-антагониста в раствор, омывающий изолированный орган (при этом на первый взгляд ничего не происходит - ведь антагонист в отличие от агониста не вызывает исследуемую биологическую реакцию), кривые зависимости уровня реакции от дозы вещества-агониста изменяются, причем изменяются по-разному, что и позволяет классифицировать антагонисты по способу их действия.

Ведь противодействовать развитию биологической реакции можно также по-разному. Можно, скажем, активировать какой-нибудь совсем другой тип рецепторов и инициировать биохимическую цепочку, которая в результате приведет к расслаблению, а не к сокращению избранной нами в качестве примера полоски желудка. Или можно образовать комплекс антагониста с тем же рецептором, не мешая образованию комплекса агонист - рецептор, но лишив рецептор способности к активации. И, наконец, можно попросту занять на поверхности рецептора место, предназначенное для агониста, и не давать ему соединиться с рецептором, и, следовательно, блокировать тем самым биологический эффект агониста.

Этот последний и наиболее зловредный (поскольку он использует известный принцип "собаки на сене") вид антагонизма называется конкурентным, а любой из остальных, соответственно, неконкурентным антагонизмом. И хоть такое название несет отчетливый отрицательный эмоциональный оттенок, свойственный роду человеческому (кому приятно обнаружить на своем законном месте конкурента, да еще и бездействующего), вещества - конкурентные антагонисты пептидных биорегуляторов сами по себе могут быть очень даже полезными и также являются объектами интенсивного драг-дизайна. Ведь если ангиотензин повышает давление крови, то его конкурентные антагонисты должны блокировать этот эффект, действуя к тому же в тех же местах, что и сам ангиотензин: иными словами, такие вещества могут стать основой для антигипертензивных лекарств с точно известной областью применения. И это только один пример потенциальных лекарственных препаратов, возможное значение которых, если их удастся найти и получить, попросту трудно переоценить.

Исследование агонистических и антагонистических свойств аналогов пептидных биорегуляторов in vitro не исчерпывается опытами с изолированными органами: здесь, как, впрочем, и всюду в современной биологии, развитие идет в глубь проблемы, что в данном случае означает дальнейшее "сближение" изучаемого пептида и рецептора. К настоящему времени экспериментаторы в состоянии, например, проследить за связыванием молекул пептида с мембранами отдельных клеток; при таком подходе факторы, влияющее на комплексообразование молекулы биорегулятора с рецептором, оцениваются не путем измерения биологической реакции, а более непосредственным образом, и "искажения информации", неизбежно возникающие на пути "от рецептора до эффекта", оказываются доведенными почти до нуля.

Следующим шагом, по-видимому, станет извлечение из клеточных мембран собственно рецепторов и анализ процесса их связывания с пептидами в наиболее "чистом" виде, что будет, несомненно, новым успехом в раскрытии тайн биохимической регуляции и очередным (в который уже раз!) триумфом биологической науки. И тем не менее все еще находятся люди, не приходящие в восторг от этих грандиозных перспектив развития пептидно-молекулярно-биологических исследований. Как ни странно, но к их числу относятся и некоторые биологи, активно работающие именно в области драг-дизайна.

Выше уже столько говорилось о необходимости самых что ни на есть фундаментальных исследований молекулярных механизмов действия пептидных биорегуляторов для создания прочных основ драг-дизайна, что проще всего было бы заклеймить упомянутых биологов как ретроградов и постараться не обращать внимания на их глубоко реакционные убеждения. Беда, однако, в том, что доводы этих потенциальных ретроградов кажутся вполне разумными не только на первый, но иногда даже и на второй взгляд. Подобные доводы сводятся к следующим утверждениям: молекулы, рецепторы, клетки - все это хорошо. Но ведь одно дело - отдельный акт объединения молекулы ангиотензина с ее рецептором, рассматриваемый сам по себе, и совсем другое - изменение давления крови in vivo, то есть сложный процесс, зависящий от множества факторов, действующих в целостном организме. И поэтому эффект сокращения, например, полоски желудка под действием какого-то аналога ангиотензина вовсе не гарантирует, что этот же аналог будет влиять на уровень давления крови.

Как видите, рассуждения вполне правдоподобны. Мало того, экспериментальная практика биологического тестирования пептидных аналогов зачастую подтверждает изложенные соображения: действительно, четко выраженная корреляция между уровнем активности аналогов на изолированном органе (а тем более - способностью аналога к связыванию с рецепторами) и активностью in vivo - явление редкое. И все же в данном случае правдоподобие - лишь подобие правды. Да, пептид, образовавший комплекс со специфическим рецептором, не всегда способен вызвать желаемый биологический эффект (вспомним о конкурентных антагонистах). Но возникновение биологического эффекта невозможно без создания прочного комплекса пептид - рецептор. То есть акт комплексообразования молекул пептида и рецептора является, как сказали бы математики, необходимым (не еще недостаточным) условием проявления биологическою реакции. Поэтому мимо этапа взаимодействия пептида с рецепторами пройти никак не удастся, и одно это обстоятельство заведомо оправдывает переход от "организменного" к "молекулярному" рассмотрению излагаемые проблем.