Живой пептид в пробирке

Итак, со стороны все выглядит просто: известно, скажем, что энкефалин - хорошее обезболивающее средство. Известно также, что энкефалин - пентапептид с аминокислотной последовательностью YGGFL или YGGFM. Казалось бы, чего проще: берем этот пептид и, если надо, применяем как безопасное лекарство вместо нежелательного морфина.

Возникает, однако, вполне законный вопрос: а откуда, собственно, мы берем нужный нам энкефалин?

На первый .взгляд ответ не должен вызывать затруднений: как известно, энкефалин был впервые получен из мозга животных, и этот же источник вполне может служить нам и впредь. Остается отправиться на ближайший мясокомбинат, договориться о поставке сырья - например, мозга овец - на оборудованный подходящим образом завод медпрепаратов, и искомое лекарственное средство готово. Кстати, точно так же производится инсулин: это лекарство, спасающее тысячи больных сахарным диабетом, начинает свой путь к аптеке о бойни.

И тем не менее в случае энкефалина, а также очень многих других биорегуляторов описанный способ получения никак не может быть рекомендован в качество промышленного. Беда как раз в той малости физиологических концентраций, которая является достоинством энкефалина как биорегулятора; общее количество пептида этого сорта (и многих других) в организме очень невелико - не более десятых, а то и сотых миллиграмма. Кроме того, отнюдь не всякий завод Минмедмикробиопрома СССР сможет выделить из исходного сырья химически чистый пептид, то есть повторить в промышленных масштабах процесс, доступный пока лишь очень немногим научным лабораториям.

Здесь стоит припомнить одну поучительную в некоторых отношениях историю. Американский ученый Э. Шэлли, получивший, как упоминалось, Нобелевскую премию, родом из Польши - он был вывезен оттуда ребенком после начала второй мировой войны. Вполне естественно, что польская пресса широко комментировала решение Нобелевского комитета, причем были газеты, которые сравнивали достижения Э. Шэлли с состоянием польской биохимии и сетовали на то, что эндорфины были обнаружены впервые хоть и поляком, но не в Польше. Однако другие газеты, ссылаясь на мнение специалистов, резонно замечали, что дело, оказывается, вовсе не в уровне отечественной биохимии: несложный подсчет показывает, что для выделения эндорфинов в количествах, достаточных для детального исследования, в стране попросту не хватит овец... (автор разделяет чувства читателей: в существование подобной аргументации действительно трудно поверить, но делать нечего - все это было написано на самом деле и абсолютно всерьез.

Короче говоря, рассчитывать на извлечение достаточных количеств чистых пептидных препаратов из животного сырья - как извлекается множество полезных соединений из сырья растительного - в большинстве случаев было бы довольно легкомысленно. К тому же многие пептидные биорегуляторы, даже у высших млекопитающих, не вполне идентичны по аминокислотным последовательностям пептидам человека, выполняющим те же функции: свиной инсулин, например, несколько отличен от человеческого.

Вот почему не остается ничего другого, как получать нужные аминокислотные последовательности пептидов искусственно - с помощью методов химического синтеза пептидов.

Для потребителя лекарства безразлично, конечно, каким, способом оно будет получено, но книга о драг-дизайне пептидных биорегуляторов не может обойтись без рассказа об основах пептидного синтеза, тем более что этот подход не только обусловил собой само существование такого дизайна, но и наложил неизгладимый отпечаток на его идеологию.

Предупредим сразу: поскольку автор не является химиком, речь может идти лишь о самых общих, причем отрывочных сведениях о принципах пептидного синтеза. По счастью, существует очень хорошая книга советских ученых В. Иванова и А. Шамина "Путь к синтезу белка", где те же проблемы изложены гораздо более квалифицированно, тщательно и интересно. Поэтому тем из читателей, кого привлекает взгляд на пептидную химию "изнутри", рекомендуется обратиться к упомянутой книге; в то же время написанное на нижеследующих страницах по необходимости представляет собой впечатление о синтезе пептидов наблюдателя хоть и заинтересованного, но постороннего.

На такого постороннего наблюдателя вид обычной химической лаборатории, где занимаются синтезом пептидов, не производит особо грандиозное впечатление. Не зажигается внушительное табло с надписью "Идет эксперимент", не рявкает неожиданно сирена, предупреждающая о смертельной опасности, и даже скромные разноцветные лампочки мигают на лабораторных приборах с интенсивностью, явно недостаточной для дежурного телефильма о самоотверженных ученых. Все происходит куда более буднично: кипят и перемешиваются жидкости в колбах и пробирках, бесцветный, невидимый пар улавливается и конденсируется в стеклянных змеевиках-холодильниках, изредка прозвенит таймер, напоминая о том, что пора добавить в колбу новую порцию вещества...

Одним словом, чье-то меткое сравнение органической химии с поварским искусством может только подтвердиться на примере синтеза пептидов, тем более что в Жаргон самих химиков-синтетиков прочно вошло словосочетание "сварить пептид". Но между тем в этих малопрезентабельных пробирках и колбочках идут сложнейшие химические процессы, для управления которыми от синтетика требуется не только та самая "частичка души", как от настоящего повара, но и немалая толика ума, терпения и даже бесстрашия: ведь многие из веществ, необходимых для пептидного синтеза, ядовиты. В том, что без этих качеств синтетику не обойтись, убеждает уже самое поверхностное знакомство с простейшими схемами пептидного синтеза.

Наиболее элементарным случаем будет, по-видимому, соединение двух аминокислот в двучленную аминокислотную последовательность - дипептид. Допустим, мы хотим получить дипептид типа R₁ R₂, то есть химическое соединение с формулой вида:

или, что то же самое, хотим провести реакцию по схеме:

NH₂ - R₁(H) - CO[OH+Н]₂N - R₂(H) - COOH → NH₂ - R₁(H) - CONH - R₂(H) - COOH + H₂O,

образовав одну пептидную связь плюс одну молекулу оды - за счет комбинации атомов, обведенных рамкой. Что ж, поместим в раствор исходные соединения - аминокислоты R₁ и R₂, добавим какой-нибудь реагент, способствующий объединению карбоксильной группы (СООН) и аминогруппы (NH₂) в прочную пептидную связь, хорошенько все перемешаем, если надо - подогреем и... И получим в результате как минимум три продукта: два дипептида: NH₂-R₁,(H)-CONH-R₂(H) - СООН и NH₂-R₂(H)-CONH-R₁(H)-COOH, и, правда, с меньшей вероятностью, один тип так называемых дикетопиперазинов:

При этом если атомное строение боковых цепей R₁ и R₂ само по себе включает амино - или карбоксильные группы, то число получившихся соединений еще возрастет, поскольку наш гипотетический реагент будет объединять все такие группы в пары без разбора и нужная молекула R₁R₂ затеряется среди многих других.

Значит, вот так, без хлопот, не удается получить даже простой дипептид. Поэтому приходится избирательно модифицировать (химики говорят "защищать") некоторые из реагирующих групп и проводить реакцию синтеза в несколько этапов: вначале получать "защищенные" аминокислоты A - R₁(H) - COOH и NH₂ - R₂(H) - В, где А и В - модифицированные амино- и карбоксильная группы, затем с помощью нужного реагента соединить незащищенные группы: A - R₁(H) - COOH + N₂H - R₂(H) - В → R₁(H) - CONH - R₂(H) - В, а потом еще и подобрать другой реагент, такой, чтобы под его воздействием группировки А и В снова превратились в незащищенные функциональные группы, но чтобы образовавшаяся пептидная связь при этом не развалилась вновь: A - R₁(H) - CONH - R₂(H) - B → NH₂ - R₁(H) - CONH - R₂(H) - COOH.

Если учесть теперь, что аминокислот, как уже отмечалось, двадцать, а групп, подлежащих защите при синтезе, не менее десятка, причем каждая требует своей индивидуальной модификации в зависимости от сложившейся ситуации; что группы, которые должны реагировать друг с другом, далеко не всегда хотят это делать и. их приходится специальным образом активировать, заставлять вступать в реакцию, и тоже с особым подходом к каждой группе и каждой ситуации; что, наконец, освобождение синтезированного "защищенного" пептида от висящих на нем защитных группировок также нужно проводить по-разному с учетом состава набора этих группировок, - тогда, быть может, читатель согласится, что сравнение химика, ведущего пептидный синтез, с гроссмейстером, разыгрывающим ответственную партию с серьезным противником и вынужденным просматривать варианты на десятки ходов вперед, вовсе не будет гиперболой.

Причем такое лестное сравнение правомерно для пептидных химиков даже сейчас, когда уже тщательно изучены многие удобные для пептидного синтеза реагенты, защитные группы, условия реакций с участием различных аминокислот и тому подобное. А что же говорить о тех гигантах, которые воздвигли и продолжают строить небоскреб химии пептидов: от немецкого химика Э. Фишера, первым предположившего и показавшего, что белки и пептиды состоят из аминокислот (второй в истории химии нобелевский лауреат - 1902 год), к швейцарскому ученому В. Дю Виньо, осуществившему первый синтез девятичленного пептида окситоцина (Нобелевская премия 1955 года), и нашему современнику, американскому синтетику Б. Меррифилду, предложившему революционное усовершенствование - так называемый твердофазный синтез пептидов (Нобелевская премия 1984 года). Здесь названы только трое, но за восемь десятилетий существования и развития химии белков и пептидов на ее небосклоне сияло и продолжает сиять несколько десятков ярких созвездий по-настоящему выдающихся ученых, в том числе - что особенно отрадно - и в нашей стране.

Успехи современного пептидного синтеза хорошо иллюстрируются простым перечислением размеров биологически активных соединений, полученных химиками, начиная с 1951 года, когда был синтезирован трипептид глутатион с широким спектром биологического действия. В 1957 году синтезирован ангиотензин - цепочка из восьми аминокислот, в 1958-м - меланотропины, вещества, изменяющие пигментацию кожного покрова у земноводных: 13-членный альфа - и 18-членный бета-меланотропин. В 1960 году появился уже известный нам нонапептид брадикинин, а в 1962 году - эледоизин, 11-членный пептид из ряда тахикининов, а в 1964 году - гастрин, пептид, влияющий на кислотность желудка и состоящий из 17 аминокислот. Все это были линейные пептиды; но параллельно шли синтезы и циклических соединений - пептидов-антибиотиков грамицидина (1956 год), актиномицина (1960 год), энниатинов и валиномицина (1963 год).

Однако настоящая гонка за длиной синтезируемой в лабораториях аминокислотной последовательности началась в середине шестидесятых годов, не без влияния методов твердофазного синтеза Б. Меррифилда. В 1963 году в Швейцарии был получен пептид из 39 аминокислот - кортикотропин свиньи, гормон, управляющий выделением стероидов из коры надпочечников. В 1965 году группа химиков КНР впервые осуществила давнюю мечту исследователей - синтез химически чистого инсулина (51-звенная двухцепочная молекула). 1968 год был ознаменован синтезом пептидного гормона человека кальцитонина, проведенным в Швейцарии (32 аминокислоты), и еще одного 33-членного пептида (фрагмент проинсулина, ФРГ). А уже в следующем году две группы американских химиков объявили о независимых рекордных достижениях: о получении полной последовательности белка рибонуклеазы А (124 аминокислоты) и почти полной последовательности рибонуклеазы S - 104 звена.

На этом этапе оказалось, впрочем, что существующие методы проверки того, насколько точно синтезированная аминокислотная последовательность воспроизводит природное строение столь длинной цепочки, не в состоянии стопроцентно гарантировать совпадение результатов природного и химического синтезов, особенно если учитывать, что, например, синтетической рибонуклеазы А было получено всего несколько десятков миллиграммов. Так, в частности, синтетический препарат обладал 70-80 процентами активности природного белка, но в принципе было вполне вероятно, что этот уровень активности обусловлен не "правильной" последовательностью, а несколько искаженными, побочными продуктами синтеза (например, цепочками с пропуском одной или нескольких аминокислот).

Поэтому в следующее десятилетие, в семидесятые годы, усилия пептидных химиков были сосредоточены в первую очередь на разработке таких методов синтеза и разделения его продуктов, которые обеспечивали бы абсолютную химическую чистоту и полную биологическую активность синтезируемых пептидов. И действительно, за это время несколько десятков природных пептидных биорегуляторов с длиной цепи от 30 до примерно 60 звеньев были воспроизведены со строгим соблюдением сформулированных требований. Этот процесс продолжается и сейчас: в качестве одного из самых последних примеров упомянем синтез 61-членного нейротоксина из яда азиатской змеи Naja naja oxiana, завершенный под руководством В. Иванова в Институте биоорганической химии имени М. М. Шемякина АН СССР в 1982 году.

И тем не менее "гонка за длиной" постепенно идет на убыль. Дело в том, что химический синтез пептидов в общем-то уже продемонстрировал свои возможности, и весьма эффектно: шутка сказать, еще в 1969 году в строго определенную последовательность удалось выстроить 124 аминокислотных остатка. Для этого понадобилось провести 369 химических реакций и еще 1131 вспомогательную операцию; а ведь обычный, не пептидный органический синтез имеет дело с цифрами, меньшими раз в сто.

Но коль скоро в принципиальных способностях синтеза пептидов воспроизводить длинные - на уровне белков - аминокислотные цепи теперь уже сомневаться не приходится, сам по себе синтез постепенно превращается из научной проблемы в проблему технологическую, что вызывает заметное охлаждение энтузиазма химиков. В самом деле, ведь цель химика - получение нового вещества, и с этой точки зрения разницы между пятью миллиграммами и десятью граммами нет никакой. Да и добавлять в молекулу все новые и новые блоки с помощью уже известных методов тоже неинтересно. Интересно другое: провести синтез пептида при каком-нибудь необычном сочетании аминокислот в цепи, придумать новую, более удобную защитную группу, применить новый эффективный реагент...

Но для этого вовсе не обязательно нанизывать друг нa друга сотни аминокислотных остатков, вполне достаточно десятка-другого. И к тому же за восемьдесят лет арсенал как защитных групп, так и реагентов для синтеза укомплектован весьма основательно, и предложить что-то действительно новое и, главное, превзойти своих предшественников очень непросто. Вот и получается, что на основных пептидных мировых форумах - европейских и американских пептидных симпозиумах, а также на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов и белков все реже и реже звучат сообщения о синтезах длинных пептидных цепей, да и вообще о методах химического синтеза пептидов.

(Говоря откровенно, есть еще одна причина охлаждения химиков к продолжению погони за длиной пептидной цепи: появление методов микробиологического синтеза пептидов и белков. Дело в том, что самую вульгарную бактерию - кишечную палочку - генные инженеры уже сейчас научили синтезировать, например, интерферон, белок длиной более чем в полторы сотни аминокислотных остатков с точностью и чистотой куда большей, чем при химическом синтезе. А обидно, знаете ли, уступать первенство какому-то там микроорганизму.)

Одним словом, сегодня наиболее важно не то, как химики синтезируют пептиды, и даже не то, какие это пептиды, а то, зачем они это делают, что за проблемы можно решить с помощью конечного результата их работы. Кстати говоря, подобный взгляд на пептидную химию существовал еще во времена Э. Фишера. Тогда умы ученых занимала весьма широкая мировоззренческая проблема: можно ли воссоздать "живое" вещество, получив белок искусственным путем.

Синтез

Это сейчас мы твердо знаем, что никаких "живых" веществ нет: молекулы, идентичные по химическому строению, идентичны и в смысле их биологического действия независимо от способа получения - в клетке или в пробирке. А сто лет назад было ясно лишь, что любые проявления жизни непременно связаны с белковым веществом (вспомним знаменитую формулировку Ф. Энгельса: "Жизнь есть способ существования белковых тел"), и казалось, что искусственное воспроизведение белка, будет означать возникновение "жизни в пробирке". Эту точку зрения наиболее образно выразил, пожалуй, крупнейший немецкий естествоиспытатель конца XIX века Э. Геккель, сказав: "Когда вы, химики, создадите истинный белок, то он закопошится!"

Что ж, химики создали "истинные" белковые и пептидные молекулы, и они действительно "закопошились", проявили биологические свойства - ив первую очередь как биорегуляторы. Более того, пептидный синтез цепочек размером где-то около тридцати звеньев доведен к настоящему времени до уровня технологической задачи. А это означает, что техническая проблема получения в чистом виде большинства известных пептидных биорегуляторов в принципе решена - их источником может служить пептидный синтез, который в совокупности без преувеличения заслуживает названия одного из самых крупных достижений органической химии нашего столетия.